[发明专利]一种siRNA序列化学修饰的方法、产品及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种siRNA序列修饰的方法，特别涉及一种通过引入异核苷酸对其进行化学修饰的方法，产品及其在疾病治疗特别是肿瘤治疗中的应用，特别是通过本发明的方法获得的siRNA及其在黑色素瘤治疗方面的应用。

背景技术

黑色素瘤是一种常见的皮肤恶性肿瘤，其发病率比较低，一般为全部恶性肿瘤的1％-3％，但恶性度高，是一种临床治疗上颇为棘手的恶性肿瘤黑色素瘤，大多源于皮肤，也可以是眼和鼻腔等处。黑色素瘤病人的早期治疗效果佳，如果瘤直径≤2mm时被诊断出，手术治愈率可达到90％。但是它生长迅速，早期筛查效果确实率差，并且早期病发就会发生肝脏、肺、骨和脑等部位的转移，恶化快速。目前恶性黑色素瘤的治愈率极低，五年的存活率低于5％，大多病人会在诊断数月后死亡。各种常规的癌症治疗方法(如手术、放疗、化疗以及生物疗法等)都无多大明显的效果。其中，化学治疗是恶性肿瘤综合治疗中必不可缺少的重要手段。但是恶性黑色素瘤对各种化学治疗药物不敏感，而且通常表现出较强的耐药性。一些常规有效的化疗药物，如烷化剂类：达卡巴嗪(DTIC)、替莫唑胺(TMZ)；铂类：顺铂(DDP)、卡铂；亚硝基类：卡莫司汀、洛莫司汀；微管蛋白抑制剂：长春碱类、紫杉醇类药物等，无论是单药治疗还是联合化疗对提高肿瘤缓解以及延长生存都没有显著的疗效。白细胞介素2(Interleukine-2)对恶性黑色素瘤病人有一定的疗效，但是毒性大、费用高，应用受到限制。目前对于转移性恶性黑色素瘤的治疗还没有建立标准的治疗手段，仍然是一个非常棘手的问题，迫切需要研发新的化疗药物、靶向药物和其他治疗手段。

同其他肿瘤一样，黑色素瘤的发生是环境因素(日光暴晒等)与遗传基因相互作用的结果，这些因素相互关联决定了肿瘤的发生和发展进程。普遍适用的Clark模型将黑色素瘤细胞恶性转化过程分为良性痣、构建不良痣、放射生长期、垂直生长期、和转移性黑色素瘤等5步。在各个恶性转化阶段，都出现了多种癌基因、抑癌基因、细胞周期调节蛋白、凋亡调节蛋白、细胞黏附分子、生长因子的异常变化，例如RAS、RAF、CDK、p53、AKT、MITF、α_vβ₃、EGF、VEGF等等。这些变异的基因和蛋白可能成为黑色素瘤恶性化程度的指标，更可能逐渐成为不同阶段肿瘤进行有效治疗的药物靶标。从分子机制角度研究这些变化基因和蛋白对黑色素瘤细胞组织的恶性化程度和转移率的影响，为揭示黑色素瘤潜在生物学病因，有效地进行疾病治疗，提供理论基础。

其中G蛋白RAS和RAF丝/苏氨酸蛋白激酶是ERK(extracellular signal-regulated kinase：细胞外信号调节激酶)级联信号通路中重要的成员，由于RAS和BRAF激酶的变异造成肿瘤细胞中ERK通道被异常激活，导致肿瘤细胞的无限增殖、存活、迁移和侵袭。但是大于90％的恶性黑色素瘤组织中发现N-RAS(RAS的一类亚型，占15％)或BRAF(RAF的一类亚型，占60-80％)的变异，导致ERK信号通路异常无控激活，是造成黑色素瘤细胞的无限增殖和快速迁移的重要原因之一。ERK信号通道是被最早发现的一个促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)级联信号通路。正常情况下，只有当细胞膜受体与胞外配体(生长因子、激素、细胞黏附分子等)配位结合后，细胞内膜的G蛋白Ra s才会交换结合GTP被激活，经过RAF、MEK1/2、和ERK1/2等激酶的逐级磷酸化激活，最后活化的ERK1/2蛋白激酶跨膜进入细胞核内，调控例如细胞增殖、存活、迁移、恶化、以及血管生成等一系列的细胞生命过程。ERK通道是正常细胞维持其正常生命过程重要的必不可少的信号通道，但是通道的异常激活(配体非依赖性)也是导致细胞癌变的主要原因之一(占30％的人类肿瘤)。除黑色素瘤外，原发性肝肿瘤、结肠肿瘤、黑色素瘤、甲状腺肿瘤、肺肿瘤、卵巢癌等，特别是侵袭、转移、恶性肿瘤组织中均检测到ERK信号通道的过度活化(图1)。ERK通道上下游各种激酶一直是肿瘤靶向药物设计的重要靶标，特别是黑色素瘤的药物设计。