[发明专利]一种纵切幼苗叶基座转化小麦的方法

说明书

技术领域

本发明属于小麦转基因领域，涉及一种农杆菌介导的，纵切幼苗叶基座转化小麦的方法。

背景技术

小麦是总产量占第二位的粮食作物，在世界各地广泛种植。随着世界人口的增长和人们生活水平的提高，人们对小麦的需求量越来越大，对小麦品质的要求也越来越高。常规育种已不能满足人们对小麦品种和品质的要求。转基因技术的发展打破了常规育种的种族限制，许多作物比如玉米、油菜等利用转基因技术已经成功培育出了优质、高效的转基因新品种。与其他作物相比，小麦的转基因育种相对滞后，转基因成功的例子较少，这由于小麦组织培养植株的再生频率低，建立稳定高效的再生体系比较困难；另一方面，小麦是多倍体作物，基因组大，遗传背景复杂，遗传转化体系不完善。目前，小麦转基因的方法主要有花粉管通道法、基因枪法、PEG介导法以及农杆菌介导法。

花粉管通道法是利用植物授粉后花粉萌发形成的花粉管，将外源DNA导入尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞中。该方法具有操作简单、耗费低廉、不需要经过繁琐的组织培养过程等优点，但是目前该方法尚不成熟，DNA的导入时间和部位往往会影响植株的结实率，最终很难得到转基因后代。基因枪法是小麦转基因育种的主要方法，在获得的小麦转基因植株的报道中，基因枪法占了绝大多数，这主要由于该方法不受作物基因型的限制、方法相对简单，目前基因枪介导的小麦转化体系已经比较完善。但是基因枪法需要经过复杂的组织培养和植株再生过程，成本花费高、周期长，不利于转基因小麦的产业化。PEG法主要是以原生质体为受体的转化方法，由于小麦的原生质体再生困难，限制了该方法的使用。

由于小麦不是农杆菌的天然宿主、谷物类作物对农杆菌没有伤感反应等原因，农杆菌介导的小麦转化一直是摆在分子生物学家和育种学家面前的一道难题。后来人们虽然实现了农杆菌介导的小麦转化，但是受到基因型、组织培养条件、外植体类型、农杆菌菌株等限制，目前农杆菌介导的小麦转化效率低，需要组织培养和植株再生阶段，周期比较长，不利于产业化的发展。由于农杆菌转化方法具有易操作、低费用、高效率、插入片段的确定性好、拷贝数低等独特优点，因此通过研究来提高农杆菌的转化效率具有主要的意义。本发明提供了一种农杆菌介导的小麦活体转化方法，除了具有上述农杆菌转化的通用优点外，还具有转化植株存活率高、不需经过复杂的组织培养等优越性，具有很高的实际操作性和市场推广价值。

 

发明内容

本发明的目的是提供一种纵切幼苗叶基座转化小麦的转基因方法，包括以下步骤：

（a） 浸泡小麦种子使之吸水饱和，培养胚轴至长1～2cm。

（b） 将含有目的基因的农杆菌用渗透培养基悬浮，所述渗透培养基含有细胞分裂素KT、植物生长素2,4-D、抗氧化剂DTT和L-Cysteine。

（c） 幼苗浸泡在渗透培养基中，用11号手术刀在小麦的叶基座中间部位纵切致伤。

（d） 致伤处理后的小麦幼苗浸没在渗透培养基中，28℃黑暗条件下 140～

170rpm培养15～30min。

（f） 处理好的小麦幼苗在吸水纸上空干，种入蛭石营养土混合土中25～28℃黑暗条件下培养2天；然后栽入大棚中。

本发明使用的渗透培养基里添加了生长素2,4-D、激动素(KT)、抗氧化剂DTT和L-Cysteine、这些添加剂能够显著提高小麦的转化效率。本发明所有的渗透培养基植物生长素2,4-D的优选用量为0.5-5mg/L，细胞分裂素KT的优选用量为0.1-4mg/L，抗氧化剂DTT的优选用量为0.5-5mM/L，L-Cysteine的优选用量为100～400mg/L。

本发明含有目的基因的农杆菌的获得，是将目的基因插入表达载体，再将该载体导入农杆菌中。常用的表达载体包括但不限于：pBin系列载体、pBI系列在、Gateway系列载体、pCAMBIA系列载体；常用的农杆菌菌株包括但不限于：AGL0、AGL1、GV3101、EHA105、LBA4404等。

本发明人研究发现小麦幼苗的培养时间以及胚轴的长度是影响小麦的转化

效率的一个重要因素。本发明中所用的小麦幼苗是在25 ℃、14小时光照10小时黑暗、保湿条件培养2~3天，小麦胚轴的长度为1-2cm。这种状态下生长的小麦幼苗纵切后植株的生长状态是最好的，转化效率也是最高。