[发明专利]通过敲除phrC基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法

说明书

一、技术领域

本发明涉及通过敲除phrC基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法，属于生物技术领域。

二、背景技术

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是目前公认的安全微生物之一，其抗菌代谢产物丰富多样，尤其是脂肽类抗菌物质，不仅抗菌谱广而且还具有生物表面活性剂的功能，因此不仅可以在农业上用于进行生物防治，而且在工业和环境保护上也有着广泛的应用。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ATCC 9943是一种可以分泌 surfactin，fengycin等抗菌肽物质的枯草芽孢杆菌（Valérie Leclère, Romain Marti, Max Béchet. The lipopeptides mycosubtilin and surfactin enhance spreading of Bacillus subtilis strains by their surface-active properties. Arch Microbiol. (2006) 186: 475-483）。其中，surfactin作为一种生物表面活性剂，与化学表面活性剂相比，其具有拥有生物降解能力，低毒，结构丰富的优点，随着对工业原料的环境适应性要求的提高，其应用于环境保护，石油开采方面潜力将会越来越大。但实际中，其并未在工业以及环境保护中广泛应用，究其原因，是因为它生产成本巨大，所以提高其产量便成为降低其生产成本的核心问题。

目前，世界范围内，提高其产量的方法主要是筛选优良菌株，以及优化发酵条件，而很少采用分子生物学技术对菌种进行改良的方法来提高其产抗菌物质的产量。但随着对抗菌肽合成分泌研究的日益深入，已经逐渐开始采用分子生物学技术，通过改造其合成分泌中信号通路等方法来对原始菌种进行基因改良，从而提高其自身合成分泌抗菌肽能力。

phrC基因（Gene ID: 937009），其表达产物枯草杆菌感受态芽孢因子（CSF）是枯草杆菌中十分重要的调控蛋白之一，在枯草芽孢杆菌各种生理代谢过程中发挥着重要的作用，相关研究表明，CSF蛋白对于抗菌物质的合成具有一定的阻碍作用。

本方法首先以枯草芽孢杆菌ATCC 9943为出发菌株，以大肠杆菌克隆载体pGEM-T为骨架构建一个基因敲除载体pCSF-EM，利用同源重组原理，通过双交换过程敲除枯草芽孢杆菌ATCC 9943基因组中phrC基因的方法构建了一个高产抗菌肽菌株FMB 25。

三、发明内容

技术问题

本发明的目的是利用分子生物学技术，构建phrC基因敲除载体，经过电转化通过同源重组将枯草芽孢杆菌ATCC 9943基因组中phrC基因敲除，从而构建一种高产抗菌肽的枯草芽孢杆菌菌株FMB 25。

技术方案

1、通过敲除phrC基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法，其特征在于：

（1）phrC基因敲除载体pCSF-EM的构建

根据枯草芽孢杆菌phrC基因设计引物PhrC5’-F和PhrC5’-R，以枯草芽孢杆菌ATCC 9943基因组DNA为模板PCR扩增部分5’端phrC基因及其上游基因，获得500bp基因片段；根据枯草芽孢杆菌phrC基因设计引物PhrC3’-F和PhrC3’-R，以枯草芽孢杆菌ATCC 9943基因组DNA为模板PCR扩增部分3’端phrC基因及其下游基因，获得500bp基因片段；根据pMUTIN4的DNA设计引物EM-F和EM-R，以pMUTIN4质粒为模板PCR扩增包括启动子和终止子的红霉素抗性基因表达框，获得850bp基因片段；扩增得到的三个基因分别克隆至pMD19-T载体，转化大肠杆菌（Escherichia coli）DH5a，经验证、测序正确后，分别命名为pCSF5’-T、pCSF3’ -T、pEM-T，于-20℃条件下保存备用；