[发明专利]一种全人源抗VEGF抗体、其制备方法及用途

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了一种全人源抗体、其制备方法及用途。

背景技术

肿瘤尤其是恶性肿瘤是当今世界严重危害人类健康的疾病，在各种疾病所致死亡中高居第二位。而且近年来，其发病率呈明显上升趋势。恶性肿瘤治疗效果差，晚期转移率高，预后多不佳。目前临床上所采用的常规治疗方法如放、化疗和手术治疗虽然在很大程度上缓解了病痛，延长了生存时间，但这些方法均存在很大的局限性，其疗效难以进一步提高。

肿瘤的生长有两个明显不同的阶段，即从无血管的缓慢生长期转为有血管的快速增殖期，血管的生成使肿瘤能获得足够的营养而完成血管切换期，如果没有血管的生成，原发肿瘤的生长不超过1-2mm，转移则无法实现。血管内皮生长因子(VEGF)是一类能促进内皮细胞分裂增殖、促进新生血管的形成、提高血管通透性的生长因子，它与细胞表面的血管内皮生长因子受体结合，通过激活酪氨酸激酶信号转导途径发挥功能。在肿瘤组织中，肿瘤细胞、肿瘤侵入的巨噬细胞和肥大细胞能分泌高水平的VEGF，以旁分泌的形式刺激肿瘤血管内皮细胞，促进内皮细胞增殖、迁移，诱导血管形成，促进肿瘤持续生长，并提高血管通透性，引起周围组织纤维蛋白沉着，促进单核细胞、成纤维细胞内皮细胞侵润，有利于肿瘤基质形成和肿瘤细胞进入新生血管，促进肿瘤转移，因而抑制肿瘤血管生成被认为是当前最具有前途的肿瘤治疗方法之一。

贝伐单抗(Avastin，bevacizumab)是抗人VEGF的人源化抗体(Cancer Res 1997；57：4593-9)，它于2004年被美国食品药品管理局批准为转移性结直肠癌的一线治疗药物。但Trastuzumab是一个人源化抗体，保留了鼠源CDR区和少量FR区鼠源残基，仍未能达到全人源化。进入上世纪90年代以后，抗体库技术的出现使人源化抗体的制备达到了一个全新的水平，它绕过了以往单抗研制过程中必需的杂交瘤途径，甚至不需要经过免疫，更为重要的是，它使人们长期以来期望获得治疗性人源抗体的梦想成为了现实，因而显示出强大的生命力。噬菌体抗体库是最早出现也是目前应用最为广泛的抗体库。噬菌体展示是由Smith(Science，1985，228(4705)：1315-1317)首先建立起来的一种将外源蛋白基因与噬菌体的衣壳蛋白基因相融合后使外源蛋白表达呈现于噬菌体表面的技术。噬菌体抗体库就是利用了以上原理使不同特异性的抗体表达在不同的噬菌体表面而用抗原对它们进行筛选(Science，1989，246(4935)：1275-1281；Proc Natl Acad Sci USA，1991，88(18)：7978-7982；Human Antibodies，1997，8(4)：155-168)。用于构建噬菌体抗体库的靶细胞可以是杂交瘤细胞、免疫的人B细胞或未经免疫的人B细胞。未经免疫的人B淋巴细胞是目前应用最多的靶细胞，它库容量大，理论上含有所有的人源抗体基因。噬菌体抗体库的筛选就是模拟体内抗体亲和力成熟的过程，用固相化抗原吸附表面表达特异性抗体的噬菌体库，然后洗脱游离的噬菌体，用抗原吸附的噬菌体感染宿主菌增殖扩增后再进行多轮的“吸附-洗脱-扩增”直至筛选到特异的人源抗体。大容量抗体库的建立是获得高亲和力人源抗体的关键，如果构建的噬菌体抗体库容量大于10¹⁰，那就可能从中筛选得到高亲和力(≥10⁹M^-1)的特异性抗体。

发明内容

本发明构建了大容量的天然人源噬菌体抗体库，从中筛选获得了一株全人源抗VEGF抗体8B13，其重链氨基酸序列为SEQ ID NO：10，轻链氨基酸序列为SEQ ID NO：12；本发明还公开了编码上述全人源抗VEGF抗体8B13的核苷酸序列，其中编码重链的核苷酸序列为SEQ ID NO：9，编码轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO：11。

本发明利用得到的全人源抗VEGF抗体8B13进行了一系列实验，实验结果表明：与人源化抗体bevacizumab相比，8B13具有更高的与VEGF的亲和力，明显更强地抑制HUVEC增殖的能力与体内抗肿瘤活性。

附图说明

图1细胞增殖实验

图2肿瘤生长曲线

具体实施方式

实施例