[发明专利]一种大豆胞囊线虫抗性基因及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种大豆胞囊线虫抗性基因及其应用，属于含有编码蛋白的RNA或DNA的化合物库领域。

背景技术

在我国，尤其是在我国东北地区，由于滥垦、滥牧、滥砍滥伐等现象的日益加剧，使得耕地沙化、干旱及盐碱地的面积逐年增加。据报道，全国盐碱地面积逾5亿亩，黑龙江省重度盐碱地面积为1600万亩(《盐碱地改造与有机产业发展论坛》，2010)。由于大豆胞囊线虫喜干旱、碱性的土壤环境(湿度60％，pH：8.0)，因此土地沙化、干旱及盐碱地面积的扩大造成了大豆胞囊线虫危害的日益严重。

大豆胞囊线虫是危害世界大豆生产的主要病虫害之一，也是危害我国大豆生产的主要病虫害。具有为害面积广泛、为害程度严重，致病性强的特点，土壤一经感染这类病虫害极难根除，目前选育具有良好适应性的抗性品种是防治大豆胞囊线虫最经济有效的措施。而对抗病基因的研究是抗性品种选育的基础。

因此克隆大豆胞囊线虫抗性基因具有重要意义。目前，已经确定的大豆胞囊线虫抗性位点约有100多个，但是根据这些位点克隆的基因却鲜有报道。随着大豆基因组测序的完成，采用生物信息学的方法进行基因的挖掘已经成为可能，另外，无论是来自单子叶植物的还是双子叶植物的抗性基因，在结构上都有一些保守性，这为抗病基因的挖掘提供了便利条件。

大豆胞囊线虫对大豆的侵染具有特异性，因此，挖掘到的候选基因无法在拟南芥等模式植物中验证其抗性，而大豆又是公认的难以转化的植物，因此，找到一种能够快速进行抗性候选基因功能验证的方法迫在眉睫。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种大豆胞囊线虫抗性基因。

所述大豆胞囊线虫抗性核苷酸序列如以下1)-4)任一所示，

1)其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

2)在严格条件下与1)限定的核苷酸序列能够杂交且能够表达的DNA分子；

3)与1)中所述核苷酸序列具有90％以上同源性，且能够表达的mRNA分子；

4)与1)中所述核苷酸序列具有90％以上同源性，且能够表达的DNA分子。

所述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

含有以上任一所述核苷酸序列的重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

所述重组载体为将上述编码基因插入pGFPGUS获得的重组载体。

扩增以上任一所述核苷酸序列的引物对也属于本发明的保护范围。

扩增权利要求1所述核苷酸序列所用的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4所示。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种大豆胞囊线虫抗性基因应用的方法。

所述基因片段在不含有此基因的植物组织中的表达应用也是本发明保护的范围。

所述植物组织为根、茎、叶、花或种子。

所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

所述单子叶植物为烟草，所述双子叶植物为拟南芥及任何栽培或者野生大豆。

所述表达为过表达。

所述表达和/或所述过表达是通过含有大豆胞囊线虫胞囊、虫卵、幼虫的试验土样及溶液在温室条件下进行表达。

所述幼虫为二龄幼虫，所述土样为将病土和无菌细沙以3∶1的比例均匀混合制备的试验病土，所述溶液为每毫升至少含有400个虫卵的悬浮液，所述温室条件为：光照模式：day/night＝16h/8h；温度模式：day/night＝28℃/25℃。

表达分析结果显示，该基因在抗病亲本中特异表达，而在感病亲本中不表达，且在抗病亲本的根部的表达量明显高于叶片中的表达量。

将本发明中的基因序列与CaMV 35S启动子连接在一起后采用发根农杆菌侵染大豆子叶节的方法，诱导感大豆胞囊线虫的品种产生毛状根，并在其诱导的过程中将目的基因转入毛状根中。将转基因阳性植株进行接种鉴定。实验证明，在接种15天后，转基因阳性根内的雌虫数明显少于对照植株根内的雌虫数；接种30天后，转基因阳性毛状根表面的胞囊数目也少于对照，且与对照相比，叶片无明显的发病症状。表明该基因在大豆对胞囊线虫的抗性中起一定的作用。