[发明专利]人前列腺凋亡反应蛋白4与凋亡素2配体融合蛋白的制法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及DNA重组技术和生物技术药物领域。更具体地，本发明涉及人前列腺凋亡反应蛋白4(Par4)或其选择性凋亡癌细胞区(SAC)，与凋亡素2配体(Apo2L)融合的蛋白，编码该融合蛋白的DNA序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞，用基因工程制备该融合蛋白的方法，以及该融合蛋白在如肿瘤等疾病治疗中的应用。

背景技术

Par4是1994年由Sells等人用差示杂交法，从凋亡的前列腺癌细胞中首次分离到的凋亡诱导基因，因此命名为：前列腺凋亡反应蛋白4(Prostate apoptosis response 4 protein，Par4)[Cell Growth Differ，1994；5(4)：457-466.]。Par4基因位于人类染色体12q21.2上，有7个外显子和6个内含子组成，编码序列有1023个核苷酸(SEQ ID NO.1)，编码的Par4蛋白质由340aa组成(SEQ ID NO.2)。现国际上将Par4统一命名为：PAWR(PRKC，apoptosis，WT1，regulator)，在各大生物数据库中的ID为：HGNC：8614；Entrez Gene：5074；Ensembl：ENSG00000177425；UniProtKB：Q96IZ0。在蛋白质缺失突变分析中发现，人Par4的145-203aa组成的59个氨基酸，为其发挥细胞凋亡作用的核心活性区域，即构成了人Par4诱导凋亡的最小功能域。这个核心区域是Par4进入细胞核、FasL/Fas定位于细胞膜、活化Fas促凋亡通路、抑制NF-κB活性等诱导凋亡的必要及充分的条件。该区域不仅能够定位于肿瘤细胞的细胞核，也能定位于正常及永生细胞的细胞核，但却只选择性地诱导肿瘤细胞的凋亡。这说明：Par4诱导细胞凋亡是由这个核心区域实现的。由于这个核心区域在正常细胞中并不诱导凋亡，但却能够诱导各种肿瘤细胞凋亡，因此称为：选择性凋亡癌细胞区(selective for apoptosis induction cancer cells domain，SAC)。Par4与SAC也可在细胞外，发挥选择性诱导癌细胞凋亡的作用[Cell，2009；138(2)：377-388.]

1995年，国外报道从人表达标签序列文库(expressed sequence tag，EST)中筛选到一种编码抗肿瘤蛋白质的基因，该基因编码的蛋白质称为肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)，又称凋亡素2配体(apoptotin-2 ligand，Apo2L)，其通过启动细胞固有的凋亡程序，可有效地诱导肿瘤和转化细胞凋亡，而对正常细胞无影响。现国际上将Apo2L统一命名为：肿瘤坏死因子(配体)超家族成员10[tumor necrosis factor(ligand)superfamily，member 10]，在各大生物数据库中的ID为：HGNC：11925；Entrez Gene：8743；Ensembl：ENSG00000121858；UniProtKB：P50591。人Apo2L基因的编码序列有846个核苷酸(SEQ ID NO.3)，编码的Apo2L蛋白质由281个氨基酸组成(SEQ ID NO.4)。业已证明Apo2L是典型的II型跨膜蛋白，其N-端第95或114位开始的胞外区可形成游离的可溶性凋亡素2配体蛋白，同样具有特异启动肿瘤凋亡作用。

由于Par4与Apo2L对诱导肿瘤凋亡作用在不同的环节，用合适的氨基酸连接臂[Protein Eng，2003；15(11)：871-879]使两者融合表达，由此所产生的重组融合蛋白质既可以通过Par4选择性诱导肿瘤细胞凋亡而抑制肿瘤，还可以通过Apo2L特异启动肿瘤细胞固有的凋亡程序而抗肿瘤。因此，本发明所得到的融合蛋白质可以在两者的协同下增强抗肿瘤的效果，还可减少两者分别给药给患者所带来的麻烦和痛苦，为抗肿瘤等疾病的治疗提供新的药物或制剂。因此，本领域迫切需要开发新的具有Par4和Apo2L两者生物活性的药物。此外，本领域还迫切需要开发成本低廉和/或步骤简便的生产工艺。

发明内容

本发明的一个目的就是提供一种新的具有Par4和Apo2L生物活性的药物，它是Par4或其活性片段SAC和Apo2L的融合蛋白。

本发明的另一目的是提供编码所述融合蛋白的DNA、含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞。