[发明专利]一种千层塔发状根系的制备与培养方法

权利要求书

1.一种千层塔发状根系的制备与培养方法，其特征在于，该方法通过如下步骤实现：取千层塔幼茎为外植体诱导愈伤组织，然后取愈伤组织与含有Ri质粒的发根农杆菌共培养，以无菌纸吸取多余菌液后转入到诱导培养基中诱导培养，在千层塔幼茎表面生长出千层塔毛状根；抑菌培养后将具有毛状根的外植体放入扩增培养基中进行毛状根的扩大培养。

2.如权利要求1所述的千层塔发状根系的制备与培养方法，其特征在于，该方法中所述千层塔幼嫩茎脱分化处理时，是取1～4cm千层塔幼嫩茎段置于B5+6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L培养基中，26℃±1下暗培养10-35d；获得新鲜千层塔愈伤组织。

3.如权利要求1所述的千层塔发状根系的制备与培养方法，其特征在于，该方法中所述发根农杆菌与千层塔愈伤组织共培养，是先将发根农杆菌在固体YEB培养基中26℃±1下培养2～4d；然后选取其单克隆菌体到液体YEB培养基中振荡培养，菌液离心收集菌体；将菌体置于B5液体培养基中混匀。

4.如权利要求1所述的千层塔发状根系的制备与培养方法，其特征在于，该方法中所述愈伤组织与发根农杆菌共培养培养基为含100umol/L乙酰丁香酮的B5固体培养基，共培养时间为1-3d；所述诱导培养基为含有400mg/L头孢噻肟钠的B5固体培养基。

5.如权利要求1所述的千层塔发状根系的制备与培养方法，其特征在于，该方法中所述介导转化的外植体放入抑菌培养基中于25℃±1暗培养，每2～9d继代培养一次，至少五次的抑菌培养处理，直至将菌除净。

6.如权利要求1所述的千层塔发状根系的制备与培养方法，其特征在于，该方法中所述将抑菌处理后具有毛状根的外植体放入毛状根扩增培养是在25℃±1暗黑振荡培养；所述扩增培养基为无激素B5液体基本培养基，所述振荡培养箱摇床转速为100～110r·min^-1。

7.如权利要求1-6任何一种所述的千层塔发状根系的制备与培养方法，其特征在于，该方法通过如下步骤实现：

(1)将千层塔幼嫩茎剪成1～5cm的小段，无菌操作台中用HgCl₂处理6～13min，酒精浸泡5～10s，无菌水冲洗3～8遍后转入到B₅+6-BA_0.5mg/L+NAA_0.3mg/L培养基中，26℃±1下暗培养12-20d，获得千层塔愈伤组织；

(2)将发根农杆菌ACCC10060菌株用1μL无菌水稀释后，涂布在20mL YEB固体培养基上，25℃±1下培养2～4d，长出克隆菌体。

(3)挑取由步骤(2)获得的发根农杆菌环单菌落接种于50mL液体YEB培养基中，25℃±3振荡培养，培养12小时，OD值为0.3～1.2，取1ml菌液置于100ml YEB液体培养基中振荡培养，培养8h，OD值为0.3～0.9，收集菌液，3500rpm下离心5～15分钟收集菌体；

(4)将步骤(3)收集的菌体置于100ml含有100umol/L乙酰丁香酮、0.7％琼脂的B₅固体培养基中并混匀；

(5)用步骤(4)混匀后得到的菌液浸染千层塔愈伤组织10～30min，取出后用无菌纸吸取多余的菌液，将浸染的千层塔愈伤组织接入到含有100umol/L乙酰丁香酮、0.7％琼脂的B₅固体培养基中1-2d；

(6)把含有400mg/L头孢噻肟钠的无激素B₅固体培养基作为诱导培养基，将步骤(5)浸染后的愈伤组织接入该诱导培养基中，进行抑菌继代培养；25℃±1暗黑培养，每3～9d继代培养一次，至少五次的抑菌培养处理，直至将菌除净；

(7)用无激素B₅液体培养基作为扩增培养基，将抑菌处理后1g的诱导出来的发状根放入50mL的扩增培养基中，25℃±1暗黑悬浮振荡培养，振荡摇床转速为100～110r·min^-1。