[发明专利]一种糙皮侧耳EST-SSR分子标记特异引物体系及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及糙皮侧耳EST-SSR分子标记特异引物体系及其应用，属于分子生物学技术领域。

技术背景

糙皮侧耳是我国第一大食用菌栽培菌种。在人们长期的生产实践中，积累了丰富而珍贵的糙皮侧耳种质资源，特别是近年来，随着糙皮侧耳栽培产业的迅速发展，糙皮侧耳的种质资源也在不断扩大。据不完全统计，目前我国糙皮侧耳栽培品种(包括国外引进菌种)已达300多个。丰富的种质资源为糙皮侧耳品种改良、新品种选育以及遗传工程奠定了基础。然而，糙皮侧耳种质资源库不断扩大，对育种工作者来说，要想知道这些育种材料的详细信息，并进行深入细致的评价鉴定，变得越来越困难。特别是由于我国食药用菌品种登记制度尚未完善，糙皮侧耳的生产用菌种比较混乱，同种异名和同名异种现象在栽培生产上非常普遍，这就给育种工作者正确评价和鉴定这些种质资源带来很大的不便。因此，如何更有效地保存和开发利用现有糙皮侧耳种质资源，特别是对特异种质材料进行有效地筛选和挖掘，是当前迫切需要解决的问题。

目前，用于作物种质资源鉴定的分子标记主要有RFLP、RAPD、AFLP、SSR等，但对于核心种质构建、基因性状鉴定、品种指纹图谱建库等研究，SSR分子标记是公认的最佳方法。

开发SSR标记主要有构建与筛选基因组文库法、微卫星富集法、省略筛库法和数据库搜索法等。其中数据库搜索法，尤其是从表达序列标签(EST)数据库中搜索，开发EST-SSR标记，已经成为一种广为采用的方法。EST-SSR标记相对于基因组SSR标记而言，由于其来自于转录谱，能够反映出转录区的差异，使EST-SSR标记可以直接与目标性状(如高产或多抗)相联系，在分子标记辅助选择上具有更高的应用价值。

然而，由于食药用真菌基因组学研究的相对滞后，EST-SSR标记技术在食药用真菌中的研究很少，仅见在香菇和真姬菇中有研究报道，而在糙皮侧耳中尚未开展该方面的研究。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种糙皮侧耳EST-SSR分子标记特异引物体系及其应用。

一种糙皮侧耳EST-SSR分子标记特异引物体系，它包括4对核苷酸序列如下所示的EST-SSR分子标记特异引物：

GL1F：ctgctcgttgtacacgcttc(SEQ ID NO.1)，GL1R：gaaagacagacgcgggatta；(SEQ ID NO.2)；

GL2F：ggtaatctcggcttcacgat(SEQ ID NO.3)，GL2R：ttgagaatcttcggcacctc(SEQ ID NO.4)；

GL4F：gagcaggcgatctctttcaa(SEQ ID NO.5)，GL4R：gcgaagggagtggtacacat(SEQ ID NO.6)；

GL19F：agtacgtagctgccgtccag(SEQ ID NO.7)，GL19R：cctgatacgtcccgtaacca(SEQ ID NO.8)。

上述体系，还包括核苷酸序列如下所示的EST-SSR分子标记特异引物：

GL26F：tatgggcatgatgaagaacg(SEQ ID NO.9)，GL26R：cgacgacgacgactatgaga(SEQ ID NO.10)。

上述体系，还包括核苷酸序列如下所示的EST-SSR分子标记特异引物：

GL38F：tctttacatccacgccatga(SEQ ID NO.11)，GL38R：caaagtgaaggtgagcgaca(SEQ ID NO.12)。

上述EST-SSR分子标记特异引物体系在糙皮侧耳遗传多样性分析和种质资源鉴定方面的应用。

上述应用，步骤如下：

(1)提取样品DNA；

(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，利用EST-SSR分子标记特异引物体系中的成对引物分别PCR扩增EST-SSR分子标记，得PCR产物；

(3)将步骤(2)制得的得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并对结果进行遗传多样性分析和多态性统计分析。

所述步骤(1)提取样品DNA，步骤如下：

(i)刮取菌丝用液氮研磨，加入CTAB及RNA酶于60-65℃水浴1-2h；

(ii)4℃ 12000rpm离心10min，取上清加入等体积的氯仿异戊醇混合液(氯仿与异戊醇体积比24∶1)，混匀后，4℃ 12000rpm离心10min；

(iii)重复步骤(ii)；