[发明专利]酵母展示脂肪酶催化合成淀粉醋酸酯的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种酵母展示脂肪酶催化合成淀粉醋酸酯的方法。

背景技术

淀粉醋酸酯是变性淀粉的一个重要类型，可生产出抗凝性、透明度及其它使用性能均好于原淀粉的产品，相较于原淀粉，经过乙酰化作用后的淀粉醋酸酯表现出如下性能特点：易糊化，糊化温度降低，粘度性稳定，溶液呈中性，即使冷却也不形成凝胶，成膜性较好，热稳定性有较大提高，其综合性能得到了很大改善，现已应用于食品、造纸、纺织、粘合剂等工业部门。

相较于化学法合成淀粉醋酸酯，生物酶法可以在较短时间内获得高取代度的反应产物。就相同反应体系而言，生物酶法相比化学法显著提升反应效率和产率，糊化液粘度和透明度也有显著提高。同时，采用生物酶法避免了化学法反应条件苛刻(强酸、碱催化、高温高压)、无特异性、产物复杂、副产物多、分离难、安全性差等弊端。脂肪酶是目前酯化合成中使用最广泛的酶，但是生产成本高、固定化过程繁杂费时大大局限了其商业化应用。

发明内容

本发明提供了一种酵母展示脂肪酶催化合成淀粉醋酸酯的方法，该方法可提高淀粉醋酸酯合成的酯化反应效率和产率，降低合成成本。

一种酵母展示脂肪酶催化合成淀粉醋酸酯的方法，包括：

将谷物淀粉溶于水，吸涨后加入醋酸酐和酵母展示脂肪酶，在65～75℃下搅拌反应2～2.5小时，分离、纯化制得淀粉醋酸酯；

以重量份计，反应各原料配比可以如下：水100份、谷物淀粉35～40份、醋酸酐1～2份、酵母展示脂肪酶1～2份。

优选的，所述的分离、纯化方法为：将反应液pH值调节至5～7进行沉淀，沉淀经洗涤，抽滤，干燥制得淀粉醋酸酯。

优选的，所述的搅拌速率为100～200转/分钟。

所述的酵母展示脂肪酶通过如下方法制备：

将线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，将所得转化子接种于BMMY培养基中，诱导培养72～144小时后离心收集菌体，菌体经冲洗、生物印迹和冷冻干燥制得酵母展示脂肪酶；

所述的重组质粒由原始载体pPIC9K和依次插入原始载体pPIC9K中MFα1信号肽下游的脂肪酶基因和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因组成。

所述的脂肪酶基因可选用Genbank号为AF229435的序列，毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115为商业化产品，可从Invitrogen公司购得。它的细胞壁α凝集素基因序列的Genbank号为M28164。

载体pPIC9K为商业化产品(如Invitrogen公司)，它存在MFα1信号肽序列(Genbank号：M17301)，同时该载体内信号肽序列上游存在AOX1启动子(Genbank号：Z46233)。重组质粒线性化处理的目的是为了与胞内基因组发生同源重组，提高表达稳定性。

优选的，所述生物印迹所用配体为油酸，它可以诱导酶结构改变，提高转化率。

本发明通过将脂肪酶基因和细胞壁α凝集素基因导入毕赤酵母细胞GS115，毕赤酵母细胞诱导培养后，脂肪酶表达并分泌到胞外，同时利用细胞壁α凝集素将该脂肪酶固定在细胞表面。利用该酵母展现脂肪酶对酯化反应进行催化，不仅提高了操作稳定性、耐热性以及重复性，反应时间也大大缩短，从原来的15小时下降到2～3小时，另外该酵母展现脂肪酶生物催化剂生产成本低，催化合成转化效率高。

具体实施方式

实施例1制备酵母展示脂肪酶

通过人工合成的方法，合成米根霉(Rhizopus oryzae)的脂肪酶基因(Genbank号：AF229435)和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因(Genbank号为M28164)，同时在脂肪酶基因C端加上连接肽序列GSSGGSGGSGGSGGSGS(linker)，连接后得到核苷酸序列pro-ROL-linker-α-agglutinin，同时在序列两端添加EcoR I和Not I酶切位点，其中pro-ROL为脂肪酶基因，α-agglutinin为细胞壁α凝集素基因。

以上述人工合成序列为模板，利用下述引物对，进行PCR扩增，

上游引物：5’-AAGGAAAAAAGAATTCGTTCCAGTTTCTGG-3’；

下游引物：5’-TTTTCCTTTTGCGGCCGCTAATGAAACG-3’

PCR反应体系为：模板DNA为1μl，高保真DNA聚合酶0.5μl，dNTP(50mM)0.4μl，上下游引物各0.5μl，10×PCR缓冲液5μl，加水至50μl。