[发明专利]酵母展示脂肪酶催化合成淀粉磷酸酯的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种酵母展示脂肪酶催化合成淀粉磷酸酯的方法。

背景技术

淀粉磷酸酯是由原淀粉与磷酸盐发生酯化而生成的一种淀粉衍生物，属阴离子变性淀粉，具有透明度高、易糊化、胶粘性强、稳定性好、凝沉性弱的特点，特别是在食品工艺中，作为一种食品添加剂，淀粉磷酸酯是良好的乳化稳定剂，清澈稳定的增稠剂，具有良好的冻结融化稳定性。

目前，淀粉磷酸酯大都是由无机磷酸盐(磷酸二氢钠NaH₂PO₄、三聚磷酸钠STP：Na₅P₃O₁₀、三偏磷酸钠：STMP(NaPO₃)₃等)与淀粉浆在弱碱性条件下经酯化反应生成，存在的主要问题是产物含磷量(即：取代度(DS))不高，产物酯化反应速不够快、反应时间过长，导致副反应的发生以及产物水解，从而影响酯化反应效率，并使淀粉磷酸酯成品中掺杂副反应产物。

相较于化学法合成淀粉磷酸酯，生物酶法可以在较短时间内获得高取代度的反应产物。就相同反应体系而言，生物酶法相比化学法显著提升反应效率和产率，均一度和稳定度也有显著提高。同时，采用生物酶法避免了化学法反应条件苛刻(强酸、碱催化、高温高压)、无特异性、产物复杂、副产物多、分离难、安全性差等弊端。脂肪酶是目前酯化合成中使用最广泛的酶，但是生产成本高、固定化过程繁杂费时大大局限了其商业化应用。

发明内容

本发明提供了一种酵母展示脂肪酶催化合成淀粉磷酸酯的方法，该方法可提高淀粉磷酸酯合成的酯化反应效率和产率，降低合成成本。

一种酵母展示脂肪酶催化合成淀粉磷酸酯的方法，包括：

将谷物淀粉溶于水，吸涨后加入NaH₂PO₄和酵母展示脂肪酶，在55～65℃下搅拌反应1～1.5小时，分离、纯化制得淀粉磷酸酯；

以重量份计，反应各原料配比可以如下：水80～100份、谷物淀粉5～10份、NaH₂PO₄1～1.2份、酵母展示脂肪酶1～2份。

优选的，所述的分离、纯化方法为：将反应液pH值调节至7.0，经乙醇将淀粉磷酸酯沉淀，洗涤，抽滤，真空干燥，得到粉末。

优选的，所述的搅拌速率为200～300转/分钟。

所述的酵母展示脂肪酶通过如下方法制备：

将线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，将所得转化子接种于BMMY培养基中，诱导培养72～144小时后离心收集菌体，菌体经冲洗、生物印迹和冷冻干燥制得酵母展示脂肪酶。

所述的重组质粒由原始载体pPIC9K和依次插入原始载体pPIC9K中MFα1信号肽下游的脂肪酶基因和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因组成。

所述的脂肪酶基因可选用Genbank号为AF229435的序列，毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115为商业化产品，可从Invitrogen公司购得。它的细胞壁α凝集素基因序列的Genbank号为M28164。

载体pPIC9K为商业化产品(如Invitrogen公司)，它存在MFα1信号肽序列(Genbank号：M17301)，同时该载体内信号肽序列上游存在AOX1启动子(Genbank号：Z46233)。重组质粒线性化处理的目的是为了与胞内基因组发生同源重组，提高表达稳定性。

优选的，所述生物印迹所用配体为油酸，它可以诱导酶结构改变，提高转化率。

本发明通过将脂肪酶基因和细胞壁α凝集素基因导入毕赤酵母细胞GS115，毕赤酵母细胞诱导培养后，脂肪酶表达并分泌到胞外，同时利用细胞壁α凝集素将该脂肪酶固定在细胞表面。利用该酵母展现脂肪酶对酯化反应进行催化，不仅提高了操作稳定性、耐热性以及重复性，反应时间也大大缩短，从原来的12小时下降到1～2小时，另外该酵母展现脂肪酶生物催化剂生产成本低，催化合成转化效率高。

具体实施方式

实施例1制备酵母展示脂肪酶