[发明专利]用于生产外源蛋白的山羊β-乳球蛋白基因座打靶载体构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一类通过同源重组将外源目的基因定向整合到山羊β-乳球蛋白基因座的基因打靶载体构建方法，属于生物技术领域。

背景技术

转基因技术能够在基因水平对家畜的基因组进行遗传修饰，从而迅速改变家畜的性状。例如：整合有生长激素基因的转基因猪在生长发育和饲料利用率等方面得到了明显地改善，而转溶葡萄球菌酶基因的山羊对乳腺炎的抗性也明显得到增强。1987年，Gorden等成功将人组织纤维酶原激活剂表达于小鼠乳腺中，建立了第一例基于小鼠的乳腺生物反应器。由于乳汁产量大、对动物自身没有损伤，且外源蛋白易于分离纯化而使得乳腺生物反应器得到了人们的重视。2006年，第一个利用转基因动物乳腺生物反应器生产的重组人抗凝血酶III(ATryn)获准上市更是激发了人们的研究热情。

然而，到目前为止所得到的转基因家畜大都是采用随机整合的方式，即目的基因在转基因动物基因组中的整合位点和拷贝数都是随机的。这就造成了目的基因在转基因动物中的表达水平不均一，有高有低，甚至由于受到位置效应的影响而无法表达。另外，由于人们对相关基因的调控序列研究尚不完全清楚，为了尽可能的包含到这些调控序列往往采用足够长的基因片段来作为调控序列，这无形中又增加了操作的难度，同时插入的外源基因片段还可能会影响基因组中相邻基因的表达，存在诱发癌症等的风险。

而基于同源重组的基因打靶技术可以实现对基因组的定向修饰，不仅能够很好的解决上述问题，同时也能够更加充分的利用靶位点的内源性调控序列，实现目标蛋白更加高效的表达。

目前，基因打靶技术在小鼠上的研究应用比较成熟，在研究基因和/或蛋白功能、构建人类疾病的动物模型等方面发挥了重要作用。然而，家畜中尚没有胚胎干细胞可供使用，制约了基因打靶技术在家畜中的研究应用。1996年，克隆羊“多莉”的降生为研究基因打靶家畜开辟了另一条途径：首先用打靶载体转染家畜体细胞，筛选得到打靶阳性细胞后通过体细胞核移植技术生产基因打靶的胚胎，再借助胚胎移植技术将基因打靶胚胎移植至代孕母畜子宫中进而获得基因打靶家畜。2000年，McGreath等借助于该技术成功将人α1-抗胰蛋白酶基因(AAT)定位整合于绵羊的原胶原基因座，获得了高表达AAT的基因打靶绵羊。随后，敲除α-1，3-半乳糖苷转移酶用以为人类提供移植器官的猪、敲除朊蛋白基因(Prp)以抵御疯牛病的奶牛、敲除囊性纤维化跨膜通道调节因子(CFTR)以用以研究人囊性纤化的模型猪、缺失免疫球蛋白重链和轻链用以生产人源化抗体的猪和牛等相继诞生，为构建乳腺生物反应器生产药用蛋白、生产器官移植动物、培育高产、抗病家畜新品种/品系奠定了基础。

β-乳球蛋白是山羊乳中主要的乳清蛋白，在乳汁中的分泌量可达2.3g/L。截至目前，尚未见到通过基因打靶的方式应用其内源性调控序列指导外源目的蛋白表达的报道。作为基因打靶的载体，应该具有良好的筛选标记、方便筛选阳性克隆、无毒副作用并方便后续操作。现有的阳性细胞富集策略以启动子缺失的方法最为有效，在家畜中对α-1，3-半乳糖苷转移酶、朊蛋白等基因位点的敲除研究即是采用启动子缺失的方法来富集阳性细胞。然而构建乳腺生物反应器所需的乳蛋白启动子在目前通常使用的打靶细胞——胎儿成纤维中并不表达，这就限制了启动子缺失富集策略的应用，这时以正负筛选方法来构建打靶载体便成为首选。相较而言，正负筛选的富集策略对基因是否转录没有要求，适用范围更加广泛。有研究表明，载体中的筛选基因会影响其整合位点邻近基因的正常表达，而且出于动物福利的考虑也需要在后续的研究中将筛选基因等附属基因结构剔除。目前，通常采用Cre/loxp系统和FLP/FTR系统来达到将筛选标记基因剔除的目的。

发明内容

本发明的目的在于，构建一种能够充分利用山羊β-乳球蛋白基因内源性调控序列的基因打靶载体，将外源性目的定位置于这些调控序列调控之下，从而使目的基因得到更加高效地表达。为构建乳腺生物反应器和抗乳腺炎等奠定基础。

为了实现上述目标，本发明采取了以下方案：

以山羊β-乳球蛋白基因5’端调控序列(BLG5)作为5’端同源臂，以山羊β-乳球蛋白基因3’端包含第6、第7外显子及下游的序列(BLG3)作为3’端同源臂，以第5外显子和第5内含子的部分序列(E5)作为连接序列用以将正筛选标记基因置于第5内含子中。

将BLG5、目的基因及E5顺次连接，再和BLG3分别连接到通用型打靶载体(如ploxpII)中正筛选标记两侧。

目的基因可以是包含起始密码子和终止密码子的基因组DNA、cDNA或其他人工合成拼接的DNA片段。