[发明专利]牛Nramp1巨噬细胞特异性表达载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.牛Nramp1巨噬细胞特异性表达载体构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

A1：血液基因组提取：

A2：Nramp1调控区序列的扩增，具体包括以下操作，A21：引物设计：从牛Nramp1全基因序列结合其核心启动子区序列设计含Vsp I和Xho I酶切位点的引物：

F：5’-CCATTAATCCCTCTACCCCTGCCTCTCC-3’

R：5’-CCTCTCGAGGCGGTGGCGATTGTGC-3’；

下划线序列为酶切位点；A22：PCR反应：以荷斯坦奶牛外周血基因组为模板，按照TaKaRa公司TaKaRa TaqTM使用说明书进行PCR反应，反应程序如下：94℃3min；94℃30s，60.8℃30s，72℃2min 20s，30个循环；72℃10min；4℃10min；用1％琼脂糖凝胶电泳分离待回收的PCR产物，切胶回收；回收产物与pMD18-T simple载体连接，转化DH5α感受态细菌进行蓝白斑筛选；挑取阳性菌落，提取质粒后用Vsp I及XhoI进行双酶切鉴定；酶切正确的质粒送样测序序列正确者命名为pMD18-P；

A3：吞噬细胞特异性表达载体pIRES2-P的构建与鉴定：

pMD18-P与pIRES2-EGFP载体分别用Vsp I及Xho I进行双酶切，胶回收获得的目的基因片段与相应载体片段用T4DNA连接酶16℃连接过夜，连接产物转化DH5α感受态细菌，选取阳性菌落增菌获得的重组质粒进行酶切鉴定，命名为pIRES2-P；

A4：牛Nramp1吞噬细胞特异性表达载体pIRES2-PN的构建与鉴定

pIRES2-P与pMD18-N4载体分别用BamH I和Sal I进行双酶切，胶回收获得的目的基因片段与相应载体片段用T4DNA连接酶16℃连接过夜，连接产物转化DH5α感受态细菌，选取阳性菌落增菌获得的重组质粒进行酶切鉴定，命名为pIRES2-PN。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所属步骤A1具体操作如下：

(1)取荷斯坦奶牛外周血血液样本200uL，加入20uL的蛋白酶K溶液，混匀；再次加入200uL的缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液变清亮后瞬时离心去除管盖内壁的水珠；

(2)加入200uL无水乙醇，充分振荡15s，瞬时离心；

(3)将上一步所得的溶液和絮状沉淀都加入吸附柱CB3中，13400×g离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；

(4)向吸附柱CB3中加入500uL缓冲液GD，13400×g离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；

(5)向吸附柱CB3中加入700uL漂洗液PW，13400×g离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；

(6)向吸附柱CB3中加入500uL漂洗液PW，13400×g离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；

(7)13400×g离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3室温放置10min，以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液；

(8)将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间部位悬空滴加100uL洗脱缓冲液TE，室温放置5min，13400×g离心2min；

(9)重复步骤8；

(10)获得的外周血基因组溶液，5uL上样，0.8％琼脂糖凝胶电泳分析。

3.根据权利要求1或2所述的构建方法获得的重组载体pIRES2-PN。

4.根据权利要求3所述的重组载体在转基因抗病动物培育中的应用。