[发明专利]EBF1基因mRNA的3’UTR在抑制基因表达中的应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及EBF1基因mRNA的3’UTR在抑制基因表达中的应用。

背景技术

植物激素乙烯信号转导中两个关键的转录因子EIN3/EIL1在蛋白水平上受到由两个F-Box类蛋白EBF1/EBF2所介导的泛素化降解调控。目前关于EBF1/EBF2基因功能的研究主要进展是被受体感知到的乙烯信号能够负调EBF1/EBF2蛋白积累(Plant Cell.2010Jul；22(7)：2384-401.)，从而使其蛋白量减少。但是对于这两个基因的mRNA的研究还没有人进行深入的研究，只是2004年曾有人报道(Mol Cell.2004 Jul 23；15(2)：173-83.)这两个基因的mRNA受到外切核酸酶EIN5的负调。

EBF1，EBF2基因成熟mRNA的3’UTR分别为695nt和590nt，至今为止还不清楚这么长的序列在生物体内是否具有某种特定的生物学功能。

发明内容

本发明的目的是提供EBF1基因mRNA的3’UTR在抑制基因表达中的应用。

为了实现本发明目的，本发明的EBF1基因mRNA的3’UTR在抑制基因表达中的应用，其是将编码EBF1 3’UTR的核苷酸序列与报告基因GFP编码序列重组得到一个结构为GFP-3’UTR的重组基因然后整合至宿主基因组中，并随宿主基因组进行表达。其中，所述宿主为植物，优选为拟南芥等。

前述编码EBF1 3’UTR的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个核苷酸形成的具有EBF1 3’UTR同等功能的核苷酸序列。

本发明还提供EBF1基因mRNA的3’UTR在抑制植物生长发育中的应用。

本发明还提供EBF1基因mRNA的3’UTR在获得乙烯不敏感型转基因植物中的应用以及EBF1基因mRNA的3’UTR在抑制转基因植物中EIN3蛋白表达水平中的应用。过量表达EBF1基因3’UTR的拟南芥植物体内EIN3蛋白水平显著下调，具有明显的乙烯不敏感表型。

本发明首次发现了EBF1基因的3’UTR具有负调植物基因表达的功能，将3’UTR用于负调植物基因表达，具有以下优点：3’UTR为非编码序列其序列较短易于克隆，且植物过量表达3’UTR后可产生与过量表达EBF1基因编码序列相同的生物学效应。

附图说明

图1为载体pEGAD的结构示意图。

图2为将EBF1 3’UTR与载体pEGAD连接后的重组基因结构。

图3分别显示了转基因35S：：GFP-EBF1U/Col-0以及转基因35S：：GFP/Col-0拟南芥幼苗的三个部位，子叶、下胚轴、根尖的荧光强度。

图4为转基因植物mRNA及蛋白水平的检测结果。

图5为转基因植物的三重反应。

图6为转基因竹中EIN3蛋白水平的检测结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中使用的试剂和材料均为市售商品。

实施例1  EBF1 mRNA 3’UTR的功能研究

构建一个新的重组基因。按照5’→3’方向从EBF1终止密码子TGA开始选取了长度为643nt的一段序列，以拟南芥基因组DNA为模板扩增目的片段，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，扩增过程所使用的PCR反应体系为：

上述体系中所用引物序列如下：

正向引物5’-ATCGAATTCTGATCAACAATTCCACTGTC-3’；

反向引物5’-TGTGGATCCCATGAATAGTCTTAAAGGTG-3’。

PCR反应条件为：

然后利用EcoR I与BamH I两种内切酶分别消化目的片段与载体pEGAD(如图1所示)，然后使用T4连接酶将目的片段插入到载体中，最终的重组基因的结构如图2所示。

利用农杆菌侵染拟南芥花序将上述重组基因转移到野生型拟南芥Col-0中，并最终得到纯和的转基因植物(共3个独立的株系)，即基因型为35S：：GFP-EBF1U/Col-0的转基因植物。同时，利用相同的方法将标签蛋白GFP也转入到植物中得到基因型为35S：：GFP/Col-0的转基因植物(共3个独立的株系)，以此植物作为实验的对照组。