[发明专利]一种石斑鱼虹彩病毒囊膜蛋白的提取方法

权利要求书

1.一种石斑鱼虹彩病毒囊膜蛋白的提取方法，其特征在于包括以下步骤：①石斑鱼胚胎细胞接种石斑鱼虹彩病毒，待细胞出现完全病变效应时，收集病毒悬液；②收集的病毒悬液冻融2-3次，去除细胞碎片，取上清液进行超速离心，收集病毒粒子，用蔗糖密度梯度离心得到纯化的病毒粒子；③将纯化的病毒粒子用质量分数0.1% SDS室温处理30分钟。

2.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于步骤②所述超速离心为28000rpm离心90分钟。

3. 如权利要求1所述的提取方法，其特征在于步骤②冻融是指将病毒悬液放入低温冰箱或液氮中冻存后室温溶解。

4.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于步骤①是将接种病毒的石斑鱼胚胎细胞经过磷酸缓冲盐溶液漂洗后加入质量分数0.25%的胰蛋白酶消化1-2分钟，加入新配置的pH 7.4～7.6的含8-10%胎牛血清的MEM培养液，25-28℃进行培养扩增；待细胞生长至对数期时接种0.01-0.1 MOI的病毒，于25-28℃培养3-4天后，收集病毒悬液。

5.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于步骤②去除细胞碎片的方法为12,000g离心30分钟，取出上清液，其沉淀用磷酸缓冲盐溶液重悬并反复冻融3次后再超声波破碎，4,000g离心20分钟。

6.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于步骤②所述蔗糖密度梯度离心为将病毒悬浮液加于30%-60%蔗糖密度梯度上，150,000 g 4℃离心1小时，收集密度梯度40%-50%之间的条带，溶于TN buffer中；100,000 g 4℃离心1小时得到纯化的病毒粒子。

7.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于步骤①收集的病毒悬液于-20～-80℃冻存保存。

8.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于步骤②收集的病毒粒子用磷酸缓冲盐溶液重悬溶解后再进行蔗糖密度梯度离心。

9.如权利要求6所述的提取方法，其特征在于所述TN buffer为50 mM Tris /HCl与150 mM NaCl的混合物，其pH 为7.5。