[发明专利]酵母展示脂肪酶催化合成维生素A乳酸酯的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种酵母展示脂肪酶催化合成维生素A乳酸酯的方法。

背景技术

维生素A(视黄醇)是一种天然的脂溶性维生素，具有维持正常视觉反应、骨骼发育、上皮组织功能，维护皮肤细胞功能、促进生长发育及清除自由基、提高免疫能力等功效，因此维生素A已经广泛应用于化妆品、保健食品等行业。维生素A系列中最常用的是维生素A和维生素A醋酸酯，但它们在光、空气、氧化剂和高温的条件下极易被氧化，现在已经有大量的研究集中于发展合成性质稳定的维生素A衍生物如维生素A脂肪酸酯(维生素棕榈酸、油酸酯)。α-羟基酸(最常见的乙醇酸和乳酸)在改善皮肤、促进角质层再生等防止皮肤老化方面功效已被证实，但由于这些酸可以迅速渗透到表皮深处，浓度超过5％时，就会严重伤害皮肤组织，维生素A的α-羟基酸酯可以有效的克服以上缺点，并且保持较高的维生素A活性，与非酯化形式相比具有更明显的护肤作用。目前市场上维生素A乳酸酯(retinyl lactylate)是用化学合成制得，然而化学法合成不仅存在化学催化剂带来的有毒物质，而且高温、高压条件下很容易发生副反应，产生有毒副作用的产物，同时还有能耗高、对设备和仪器要求高、对环境污染严重等问题，酶法合成可以避免这些问题。目前已有利用脂肪酶合成维生素A乳酸酯的报道，但是由于脂肪酶(游离酶或固定化)制作复杂、生产成本高限制了这一生物催化过程的商业化、规模化应用。

发明内容

本发明提供了一种酵母展示脂肪酶催化合成维生素A乳酸酯的方法，可显著降低维生素A乳酸酯生产成本，同时达到较高的酯化反应效率和产率。

一种酵母展示脂肪酶催化合成维生素A乳酸酯的方法，包括：

将维生素A醋酸酯和乳酸溶于有机溶剂中，加入酵母展示脂肪酶，无氧条件下于50～60℃反应10～14小时，分离、纯化制得维生素A乳酸酯。

优选的，所述的有机溶剂为正己烷。

优选的，每升有机溶剂中维生素A醋酸酯、乳酸和酵母展示脂肪酶的加入量分别为20～100g、30～100g、50～100g。

搅拌速率为200～250转/分钟。

所述的分离、纯化为：将反应液离心，取上清液，旋转蒸发除去有机溶剂，水洗后溶于正己烷，重结晶。

所述的酵母展示脂肪酶通过如下方法制备：

将经线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，将所得转化子接种于BMMY培养基中，诱导培养72～144小时后离心收集菌体，菌体经冲洗、生物印迹和冷冻干燥制得酵母展示脂肪酶；

所述的重组质粒由原始载体pPIC9K和依次插入原始载体pPIC9K中MFα1信号肽下游的脂肪酶基因和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因组成。

所述的脂肪酶基因可选用Genbank号为AF229435的序列，毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115为商业化产品，可从Invitrogen公司购得。它的细胞壁α凝集素基因序列的Genbank号为M28164。

载体pPIC9K为商业化产品(如Invitrogen公司)，它存在MFα1信号肽序列(Genbank号：M17301)，同时该载体内信号肽序列上游存在AOX1启动子(Genbank号：Z46233)。重组质粒线性化处理的目的是为了与胞内基因组发生同源重组，提高表达稳定性。

优选的，所述生物印迹所用配体为油酸，它可以诱导酶结构改变，提高转化率。

本发明通过将脂肪酶基因和细胞壁α凝集素基因导入毕赤酵母细胞GS115，毕赤酵母细胞诱导培养后，脂肪酶表达并分泌到胞外，同时利用细胞壁α凝集素将该脂肪酶固定在细胞表面。利用该酵母展示脂肪酶对酯化反应进行催化，可有效提高操作稳定性、耐热性以及重复性，由于酶反应的特异性该酶能大幅度抑制副反应的发生，终转化率(以维生素A计)在87％以上。

具体实施方式

实施例1 制备酵母展示脂肪酶

通过人工合成的方法，合成米根霉(Rhizopus oryzae)的脂肪酶基因(Genbank号：AF229435)和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因(Genbank号为M28164)，同时在脂肪酶基因C端加上连接肽序列GSSGGSGGSGGSGGSGS(linker)，连接后得到核苷酸序列pro-ROL-linker-α-agglutinin，同时在序列两端添加EcoR I和Not I酶切位点，其中pro-ROL为脂肪酶基因，α-agglutinin为细胞壁α凝集素基因。

以上述人工合成序列为模板，利用下述引物对，进行PCR扩增，