[发明专利]一种利用RNA干扰技术防治烟粉虱的方法

权利要求书

1.一种利用RNA干扰技术防治烟粉虱的方法，步骤如下：

(1)根据烟粉虱的基因序列选取RNAi的靶序列IAP基因，并设计靶序列的PCR扩增引物，上游引物的5’端引入BglII酶切位点，下游引物的5’端引入Xho I酶切位点；

(2)提取烟粉虱的RNA并通过反转录获得cDNA，然后用步骤(1)制得的PCR扩增引物对cDNA中含有的IAP基因的cDNA进行PCR扩增，纯化后制得目的基因；

(3)将步骤(2)制得的目的基因插入到pMD18-T载体中，用BglII和Xho I酶切获得酶切片段，将其反向连接至pUC-RNAi载体，再用BamH I和Sal I酶切获得酶切片段，将其正向连接至pUC-RNAi载体，用Pst I酶切pUC-RNAi载体，回收酶切片段，将其插入用Pst I酶切的表达载体pCAMBIA2300-35S中，制得含有目的基因的表达载体；

(4)将步骤(3)制得的含有目的基因的表达载体转化作物，获得具有防治烟粉虱的转基因作物，种植该作物即可。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的引物，序列如下：

上游引物：GAAGATCTTCGGCGATGTTCCTTGTTTAG，

下游引物：CCGCTCGAGCGGACTGAGATGATTCCGAGAC。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中PCR扩增体系为：

2μl cDNA，20μM引物0.5μl，5U/μl Taq酶0.5μl，10×Taq Buffer 5μl，10mM dNTP1μl，补ddH₂O至总体积50μl；

PCR扩增扩增条件为：94℃变性1min，51℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环，72℃延伸7min，4℃保温。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中的转化为叶盘法转化。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述作物为烟草Nc89。

6.一种权利要求1所述方法的专用引物，其特征在于，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。