[发明专利]酵母展示脂肪酶催化合成淀粉黄原酸酯的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种酵母展示脂肪酶催化合成淀粉黄原酸酯的方法。

背景技术

淀粉黄原酸酯是淀粉与CS₂在碱性条件下进行黄原酸化反应而制得的一种淀粉衍生物。可在酸性条件下吸附废水中的各种重金属离子，常用于电镀废水的重金属离子回收，淀粉黄原酸酯作为一种传统净化废水的方法不仅能耗低、功效高、反应迅速、操作简便，而且能有效回收重金属，在取得环境效益的同时，还能获得经济效益和社会效益。

相较于化学法合成淀粉黄原酸酯，生物酶法可以在较短时间内获得高取代度的反应产物。就相同反应体系而言，生物酶法相比化学法显著提升反应效率和产率，均一度和稳定度也有显著提高。同时，采用生物酶法避免了化学法反应条件苛刻(强酸、碱催化、高温高压)、无特异性、产物复杂、副产物多、分离难、安全性差等弊端。

脂肪酶是目前酯化合成中使用最广泛的酶，但是生产成本高、固定化过程繁杂费时大大局限了其商业化应用。本发明通过展示技术使脂肪酶固定于酵母细胞表面并成为酵母细胞活体组成部分，构建成酵母全细胞脂肪酶生物催化剂，用于高效催化合成淀粉黄原酸酯。

发明内容

本发明提供了一种酵母展示脂肪酶催化合成淀粉黄原酸酯的方法，可显著提高酯化反应效率和产率，降低成本。

一种酵母展示脂肪酶催化合成淀粉黄原酸酯的方法，包括：

将谷物淀粉溶于水，吸涨后加入CS₂和酵母展示脂肪酶，在45～55℃下搅拌反应1～1.5小时，分离、纯化制得淀粉黄原酸酯；

以重量份计，反应各原料配比可以如下：水100份、谷物淀粉35～40份、CS₂1～2份、酵母展示脂肪酶1～2份。

所述的搅拌速率为100～200转/分钟。

优选的，所述的分离、纯化方法为：将反应液pH值调节至5～6进行沉淀，沉淀经洗涤，抽滤，干燥制得淀粉黄原酸酯。

所述酵母展示脂肪酶通过如下方法制备：

将经线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，将所得转化子接种于BMMY培养基中，诱导培养72～144小时后离心收集菌体，菌体经冲洗、生物印迹和冷冻干燥制得酵母展示脂肪酶；

所述的重组质粒由原始载体pPIC9K和依次插入原始载体pPIC9K中MFα1信号肽下游的脂肪酶基因和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因组成。

所述的脂肪酶基因可选用Genbank号为AF229435的序列，毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115为商业化产品，可从Invitrogen公司购得。它的细胞壁α凝集素基因序列的Genbank号为M28164。

载体pPIC9K为商业化产品(如Invitrogen公司)，它存在MFα1信号肽序列(Genbank号：M17301)，同时该载体内信号肽序列上游存在AOX1启动子(Genbank号：Z46233)。重组质粒线性化处理的目的是为了与胞内基因组发生同源重组，提高表达稳定性。

优选的，所述生物印迹所用配体为油酸，它可以诱导酶结构改变，提高转化率。

本发明通过将脂肪酶基因和细胞壁α凝集素基因导入毕赤酵母细胞GS115，毕赤酵母细胞诱导培养后，脂肪酶表达并分泌到胞外，同时利用细胞壁α凝集素将该脂肪酶固定在细胞表面。利用该酵母展现脂肪酶对酯化反应进行催化，不仅提高了操作稳定性、耐热性以及重复性，反应时间也大大缩短，从原来的15小时下降到2～3小时，另外该酵母展现脂肪酶生物催化剂生产成本低，催化合成转化效率高。

具体实施方式

实施例1制备酵母展示脂肪酶

通过人工合成的方法，合成米根霉(Rhizopus oryzae)的脂肪酶基因(Genbank号：AF229435)和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因(Genbank号为M28164)，同时在脂肪酶基因C端加上连接肽序列GSSGGSGGSGGSGGSGS(linker)，连接后得到核苷酸序列pro-ROL-linker-α-agglutinin，同时在序列两端添加EcoR I和Not I酶切位点，其中pro-ROL为脂肪酶基因，α-agglutinin为细胞壁α凝集素基因。

以上述人工合成序列为模板，利用下述引物对，进行PCR扩增，

上游引物：5’-AAGGAAAAAAGAATTCGTTCCAGTTTCTGG-3’；

下游引物：5’-TTTTCCTTTTGCGGCCGCTAATGAAACG-3’