[发明专利]大熊猫精液冷冻保存液及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物材料保存技术领域，具体涉及大熊猫精液冷冻保存液及其制备方法。

背景技术

大熊猫是我国的特有种，属世界濒危珍稀动物，截至2004年结束的第三次全国大熊猫种群数量调查，虽然大熊猫野外种群数量由上世纪80年代的1100余只上升到1590余只，但依然没有摆脱濒危的境地。经过多年的努力，我国大熊猫圈养繁殖水平有了很大提高，至2008年底，圈养种群数量已达到268只。但是，如何避免近亲繁殖已成为大熊猫圈养繁育必须面对的问题。通过对大熊猫精液保存技术研究，可以使遗传性能好的雄性个体的精液得以长期保存，从而为大熊猫人工授精繁育的开展奠定了基础，同时为减缓因近交和遗传漂变所造成大熊猫种群遗传多样性降低的速度，提高大熊猫繁殖性能、扩大种群数量等有着重要意义。

近年来，成都大熊猫繁育基地进行了大熊猫精液冷冻保存液的研究，获得的冷冻保存液配方为：20％卵黄、12％蔗糖、5％甘油及少量ATP，用该保存液进行大熊猫精液的冷冻保存，解冻后进行精子活力检查，平均为55.79％(侯蓉等，2005.大熊猫细管冻精制备程序的建立与应用.中国兽医学报，25(3))。本发明人按照该配方和方法进行多次冷冻保存实验，解冻后精子活力平均为36.56％，远低于报道中的效果。所以，至今该保存液并没有在大熊猫精液冷冻保存中得到应用。

目前，大熊猫人工繁育中的精液冷冻保存，包括成都大熊猫繁育基地、卧龙大熊猫研究中心以及北京动物园等，均采用美国Irvine Scientific公司生产的TEST保存液完成。用TEST保存液在冷冻保存解冻后的精子活力为40～60％(黄炎等.2000.大熊猫电刺激采精及精液冷冻保存研究.四川师范学院学报(自然科学版)，21(3)；黄炎等.2000.大熊猫精液的保存实验.中国兽医杂志，26(6))，经冷冻后的精液可以在液氮中保存20～60年。

采用TEST保存液进行大熊猫精液的冷冻保存，虽然解冻后的精子活力达到了人工授精要求，但是存在有以下问题：①其配方不公开，国内没有生产、购买不方便，而且价格昂贵，每盒(5ml x 20瓶)7000元；②保质期短，在-10℃条件下保存期小于1年。由于大熊猫是季节性发情、每年一次，且发情期持续短，每年采精进行冷冻保存时，需提前订货购买TEST保存液，当年剩存的TEST保存液在来年无法使用。另外，冷冻保存液是大熊猫人工繁育中的基础试剂，需求量比较大，又是含有蛋白质的营养试剂，以进口方式并进行长时间保存，对于精液的即时冷冻保存会造成影响，也给工作带来不便。所以，冷冻保存液采用现配现用方式的效果最好。

发明内容

针对现有技术所存在的问题，本发明的目的是提供一种大熊猫精液冷冻保存液及其制备方法，使该保存液在解冻后的精子活力满足人工授精要求的前提下，成本低廉、制备方法简单，可以现配现用，实现精液的即时保存。

本发明所提供的大熊猫精液冷冻保存液按100ml配制，其组成配比为：葡萄糖4～6g、果糖4～6g、柠檬酸三钠0.05～0.15g、卵黄15～18ml、丙三醇6～7ml、以及青霉素和链霉素各0.5万IU～2万IU，余量为双蒸水。

所述冷冻保存液的优化配比为：葡萄糖5g、果糖5g、柠檬酸三钠0.1g、卵黄16ml、丙三醇6.7ml、以及青霉素和链霉素各1万IU，余量为双蒸水。由于大熊猫精液呈弱碱性，pH在7.2～7.5，以个体不同有所差异，为避免酸碱度变化对精子的影响，所述冷冻保存液的pH为7.4。

本发明冷冻保存液中，葡萄糖、果糖和卵黄为精子的代谢提供能量，因为在冷冻过程中和解冻后精子都需要能量维持自身的新陈代谢；柠檬酸三钠是维持保存液中适当的渗透压和电解质平衡，以保证精子内外的渗透压平衡，其还具有缓冲作用，可以中和精子代谢产生的酸，防止pH的改变；由于冷却过程中的精液要从体温降至4～5℃，并需平衡一段时间，卵黄中的卵磷脂可以保护精子免受伤害；在冷冻和解冻的操作中，精子内的组织液和精液液体都要经历由液态到固态的变化，会出现冰晶状态，丙三醇能够保护精子免受冰晶的伤害；青、链霉素主要是控制操作过程中的微生物污染。

所述大熊猫精液冷冻保存液的制备方法为，根据制备量按上述比例称、量各组分，将固体组分用双蒸水溶解，再加入溶解后的青霉素和链霉素溶液，混合均匀，然后吸取鲜卵黄加至混合液中搅拌均匀，再将丙三醇加入混合液中搅拌均匀，余量用双蒸水补足，充分混合均匀，置于4～5℃保存备用。