[发明专利]改进的细菌外膜囊泡

说明书

此为2003年9月1日提交的专利申请CN03823723.7(PCT/IB2003/004293)，“改进的细菌外膜囊泡”的分案申请。

技术领域

本发明涉及用于免疫目的的囊泡制剂。

背景技术

抗脑膜炎奈瑟氏球菌(N.menigitidis)感染免疫的多种方法之一是使用外膜囊泡(OMV)。挪威国立卫生院(Norwegian National Institute of Public Health)已生产出一种有效抗B血清群的OMV疫苗(例如文献1)，但尽管此疫苗安全且可预防MenB疾病，其功效限于针对用于制造该疫苗的菌株。

“RIVM”疫苗以含6种不同PorA亚型的囊泡为基础，已在II期临床试验中显示在儿童中具免疫原性[2]。

文献3揭示了一种抗脑膜炎球菌B血清群不同病原血清型的疫苗，该疫苗以保留了一种65-kDa蛋白复合体的OMV为基础。文献4揭示了一种包含OMV的疫苗，该OMV来自基因修饰过的脑膜炎球菌株，该OMV包含：至少一种1型外膜蛋白(OMP)，但不包含2/3型OMP。文献5描述含表面环突变OMP的OMV和含脑膜炎球菌脂多糖(LPS)衍生物的OMV。

文献6描述了含OMV的组合物，其中添加了运铁蛋白结合蛋白(如TbpA和TbpB)和/或Cu，Zn-超氧化物岐化酶。文献7描述了含OMV并添加了多种蛋白的组合物。文献8揭示的膜囊泡制剂由含有经修饰fur基因的脑膜炎奈瑟氏球菌制得。

除脑膜炎奈瑟氏球菌B血清群之外，还制备了其它细菌的囊泡。文献9揭示了制备针对脑膜炎球菌A血清群的基于OMV的疫苗的方法。文献10和11描述了淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhoeae)的囊泡。文献12描述了由乳糖奈瑟氏球菌(N.lactamica)制备的囊泡制剂。还制备了粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)[13，14]、弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)[15，16]、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[15，16]、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)[17]、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)[18]、流感嗜血杆菌(Hacmophilus influenzae)[19&20]和幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)[21]的囊泡。

细菌囊泡制剂的一个缺点是缺少重要的保护性抗原。为在OMV制剂中保留如NspA等抗原，文献20提出必须上调nspA的表达，同时敲除porA和cps。本发明的一个目标是提供改良囊泡制剂及其生产方法。具体地说，发明旨在提供保留了脑膜炎奈瑟氏球菌的重要细菌性免疫原性成分的囊泡。

发明内容

现有技术制备脑膜炎球菌OMV的方法在破坏细菌膜时使用洗涤剂[参见例如文献22，其中使用脱氧胆酸盐洗涤剂]。发明的基础是发现在基本上没有洗涤剂存在下破坏膜产生的OMV保留了重要细菌免疫原性成分，尤其是(i)保护性NspA表面蛋白，(ii)蛋白‘287’和(iii)蛋白‘741’。′

所以，本发明提供从细菌生产外膜囊泡制剂的方法，其中在基本上没有洗涤剂存在下破坏细菌膜。本发明还提供可用发明方法获得的OMV制剂。

就获得NspA^+ve囊泡而言，发明方法比象文献20所述那样进行多步骤遗传操作简单得多。

发明方法通常包括下列基本步骤：(a)在基本上没有洗涤剂存在下处理细菌细胞；(b)离心步骤(a)所得的组合物以将外膜囊泡与处理后细胞和细胞碎片分开，收集上清；(c)高速离心步骤(b)所得的上清并收集沉淀中的外膜囊泡；(d)将步骤(c)所得的沉淀重新分散在缓冲液中；(e)根据步骤(c)进行第二次高速离心，收集沉淀中的外膜囊泡；(f)将步骤(e)所得的沉淀重新分散在水介质中。

本发明方法还可以包括下列步骤：(g)将步骤(f)所得的再分散组合物通过至少2个孔径递减的滤器进行除菌过滤；(h)可选地将步骤(g)所得组合物加入药学上可接受载体中和/或佐剂组合物中。

步骤(a)产生细菌外膜囊泡，这些囊泡一般包含基本呈现各自天然形式的外膜成分。这一步骤方法的优点在于保留了膜成分NspA、‘287’和‘741’。

步骤(b)通常采用约5000-10000g，至多1小时的离心。

步骤(c)和(e)一般采用约35000-100000g，至多2小时的离心。离心步骤优选在2-8℃进行。