[发明专利]一种基于免疫荧光技术的隐孢子虫和贾第虫活性评价方法

说明书

技术领域

本发明涉及隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)和贾第虫(Giardia)活性的评价方法，特别是涉及基于免疫荧光技术的隐孢子虫和贾第虫活性评价方法。

背景技术

隐孢子虫和贾第虫对饮用水的污染已对公民的健康构成了严重的威胁，且隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊（以下简称“两虫”）业已成为备受关注的介水传播生物危险因素之一。在我国新颁布的《生活饮用水卫生标准》中，已经将隐孢子虫和贾第虫作为非常规指标且规定了其限值，但根据目前我国的饮用水处理工艺及水源水质和供水水质现状来看，存在“两虫”爆发的潜在风险，为保障饮用水安全，研发出一种高效、低廉的“两虫”活性评价方法具有重要和迫切的现实意义。

两虫对外界环境有较强的抵抗力，常用的消毒剂（氯气、二氧化氯、氯胺等）在标准浓度下对包囊并无很强的杀灭作用。UV应用于饮用水消毒已有较悠久历史，此技术被认为有效的微生物杀灭技术，包括：细菌、真菌甚至两虫。2006年Hijnen [Hijnen.W.A.M., Beerendonk.E.F., et al. Water Research, 2006, 40(1):3]等人的研究表明：相较于病毒，两虫孢（卵）囊与UV具有较强的敏感性。近年来，UV灭活两虫已引起各国学者高度重视，并进行了大量报道，其中包括：脉冲紫外灯[Slifko. T, Raghubeer. E, Rose. J. B, Journal of Food Protection, 2000, 63:9]、低压紫外灯[Shin. G. A, Linden. K. G, et al. Applied and Environmental Microbiology, 2001, 67(7): 3029]、中压紫外灯[P. A. Rochellea, S. J. Uptonb, et al. Trends in Parasitology, 2005, 21(2):81]等。

目前常用的两虫活性评价方法有细胞感染、荧光活体染色、动物感染、RT-PCR和体外诱导脱囊等，其中尤以荧光活体染色较为常用。UV破坏了卵(孢)囊内部的DNA使其失去了活性，但由于其囊壁保存完好，在荧光活体染色中仍显阳性，因此荧光活体染色（DAPI/PI）不能准确评价某些消毒剂或方法如UV对卵(孢)囊的灭活效果；且荧光活体染色与动物感染试验相比，检测限明显高估，无法准确评价UV照射两虫的杀灭效果。因此，探索一种高效评价UV消毒两虫效果的方法不仅可以避免传统荧光染色法测定两虫活性的理论偏差，提高UV消毒效果的评价可信度，而且能够进一步完善两虫灭活效果评价方法体系，促进健康饮水保障系统建设。

发明内容

本发明为解决UV灭活隐孢子虫和贾第虫效果评价误差大，成本昂贵，专业操作水平要求较高等问题，而提出的一种新型隐孢子虫和贾第虫活性评价方法。

本发明采用的技术方案是：提供一种基于免疫荧光技术的隐孢子虫和贾第虫活性评价方法，包括以下步骤：

1）提供经紫外消毒处理后的待测水样；

2）制备检测水样中经紫外照射后隐孢子虫和贾第虫虫卵产生的嘧啶二聚体TDs的免疫荧光体系；

3）荧光显微镜评价活性，统计灭活率。

所述步骤2是在待测水样中加入抗嘧啶二聚体单克隆抗体，利用抗嘧啶二聚体单克隆抗体与TDs发生竞争性免疫结合反应。在待测水样中加入4’,6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐或溴化乙锭作为染色液，以异硫氰酸荧光素为标记，抗免疫球蛋白IgG为荧光底物。

抗嘧啶二聚体单克隆抗体是鼠源抗嘧啶二聚体免疫球蛋白anti-TDs Ig G；抗免疫球蛋白为标记了异硫氰酸荧光素FITC的抗鼠源免疫球蛋白FITC-anti-mouse IgG作为二抗。所述DAPI染色液为含有1mg/L DAPI的超纯水溶液。

所述步骤2中，先取一定量步骤1的待测水样室温风干，经无水甲醇固定，经HBSS液冲洗，经温浴，之后与鼠源抗嘧啶二聚体免疫球蛋白孵育，HBSS液冲洗；再室温风干后与标记了FITC的抗鼠源免疫球蛋白孵育，并用HBSS液冲洗；再次室温风干后与DAPI染色液复染色，处理后的样品进入第3步灭活结果鉴定，检验两虫灭活率。

取步骤1的待测水样室温风干时，采用先冻融后风干或者先风干后冻融的工序。

所述步骤1中，还包括对待测水样进行纯化或富集隐孢子虫和贾第虫活体的预处理工艺。