[发明专利]烟曲霉荧光定量PCR检测方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及烟曲霉荧光定量PCR检测方法。 

(二)发明背景

烟曲霉是常见的空气真菌，也是真菌中研究较为清楚能产生毒性物质的真菌。其致病因子可分为毒素和酶两大类，在烟曲霉致病中共同起作用：首先，烟曲霉所产生的蛋白酶可能不直接参与烟曲霉侵入宿主体内，但可以促进真菌与宿主组织粘附和穿透，由于呼吸道上皮构成内外环境屏障，微生物要进入肺实质细胞形成肺部感染，首先要穿透上皮组织，而烟曲霉可以产生某些蛋白酶，尤其丝氨酸蛋白酶，可促进肺泡上皮细胞脱落，有利于烟曲霉侵入；其次，烟曲霉毒素可以扰乱粘膜防御功能，抑制吞噬细胞功能，通过抑制免疫反应，或破坏局部组织，而促进真菌生长繁殖，危害人体健康。早在1848年就发现烟曲霉可以引起人的感染，至今依然是临床上重要的条件致病真菌，过敏体质者吸入烟曲霉孢子易发生肺部感染。近年来，在临床上烟曲霉已经成为仅次于白色念珠菌的一种重要的病原真菌，其毒素可以直接造成机体损害或降低机体免疫力，严重的可危及生命。烟曲霉对动物也有很大的危害，如烟曲霉产生的毒素会导致马的脑白质软化症，引起兔子的呼吸道疾病，造成畜禽体重减少，腹泻，饲料转化率低和肝坏死，导致猪的胰脏坏死，肝损伤及肺水肿等。研究表明，当烟曲霉菌分生孢子浓度达到109CFU/m³，雏鸡暴露在这样的环境下，数周会造成急性症状，当浓度达到1010CFU/m³以上时只需1天就可造成急性症状，由此可见，真菌气溶胶的危害与浓度密切相关。 

长期以来人们对气载微生物的检测主要是依靠培养技术法，它既可以计算出气载微生物的浓度，也便于对优势微生物进行形态学鉴定，同时通过Anderson采样器还可以测定气溶胶的粒子大小和分布规律，因此培养技术法是目前国内外检测微生物气溶胶应用广泛，结果可靠的方法。但是培养计数法依赖于微生物的可培养性，首先不是所有的微生物都能够在采样培养基上生长，不同的微生物有不同的生长要求，例如MEA就不适合嗜干性真菌的生长；其次生物气溶胶在采样过程中很容易失活，从而无法在培养基上形成菌落；再次空气中许多微生物已经死亡，但是其细胞成分仍然能够导致过敏或者引起中毒，这部分气溶胶也无法通过培养技术来进行测定。据Parkes和Taylor计算，可培养的微生物大约占空气微生物总数的0.1-10％左右，所以说培养计数法很容易低估空气中生物气溶胶的总量。基于分子生物学技术的荧光定量RT-PCR方法，能够快速特异、敏感和高效的对样品进行检测，对疾病的早期治疗及疫情的控制提供参考。 

(三)发明内容

本发明建立了灵敏度高、特异性强、操作简单的烟曲霉荧光定量PCR检测方法，该方法速度快、高通量，能大大缩短检测周期，为疾病的治疗和疫情的控制提供保障，并能避免检测过程中可能造成的生物污染。 

本发明的具体步骤是： 

1、引物设计 

参照GeneBank公布的Mto1的基因序列(GenBank accession No.XM-742541)，应用Primer Premier 5.0软件设计了特异性引物序列： 

2、真菌DNA提取 

将购买自中国普通微生物菌种保藏中心(中国科学院微生物研究所，北京)的标准烟曲霉菌株接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，28℃、7天培养，用于DNA提取。在无菌条件下用接种环刮取少量菌丝体于预先加入提取液的1.5ml离心管中，用试剂盒附带的研磨杵将菌丝体捣散，然后按试剂盒(天根公司，快速DNA提取扩增套装，目录号：KG201，说明书见天根公司网站)说明进行DNA提取。 

3、PCR扩增 

PCR总体系为25μl，其中2×PCR Master Mix12.5μl，上、下游引物(FP和RP)各1μl，模板1μl，余下用灭菌ddH₂O补足。反应条件为：95℃预变性3min，然后94℃30s，55℃30s，72℃30s，进行30个循环，最后72℃延伸15min。反应结束后，取5μlPCR产物于1％琼脂凝胶中电泳。 

4、质粒标准阳性模板的制备 

①确定阳性质粒：PCR产物于1％琼脂凝胶中电泳后，用胶回收试剂盒提取DNA，按照常规方法将目的片段与pMD18-T载体连接，并转化DH5α感受态细胞中，于氨苄青霉素酶培养基37℃培养过夜，挑选转化长出的菌落进行单克隆培养，酶切鉴定挑取的阳性质粒，并通过序列测定进行分析，测定的序列与Genebank上的标准毒株序列对比分析，确定阳性质粒。