[发明专利]多疣壁虎Hoxc10蛋白的体外表达及多克隆抗体制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种多疣壁虎Hoxc10蛋白的体外表达及多克隆抗体制备方法。

背景技术

同源异型框基因(homeobox gene，Hox)，编码一个高度保守的转录因子家系，这些转录因子在胚胎发育的形态发生中起关键作用，能够维持正常的体节形成, 菱脑原节形成和发育，以及后脑和各个器官、组织及四肢的正常的分化和发育。Hoxc10是Hox基因家族中一位重要的成员。已有研究表明，Hoxc10不仅影响脊椎动物的胚胎发育，尤其是神经系统发育，同时也影响脊椎动物的断肢及尾部的再生过程。市场上多是针对小鼠、人及大鼠Hoxc10的抗体，这些抗体与羊、兔、猴等有一定的交叉反应，针对多疣壁虎的Hoxc10蛋白高特异性、高滴度的抗体目前还没有。为进一步探究Hoxc10在多疣壁虎断尾再生过程中的作用及其他相关生物学功能，本专利拟制备兔源抗多疣壁虎Hoxc10抗体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能大量制备出高质量的抗多疣壁虎Hoxc10蛋白抗体的多疣壁虎Hoxc10蛋白的体外表达及多克隆抗体制备方法。

本发明的技术解决方案是：

步骤1）、多疣壁虎Hoxc10的EST序列的获得

根据同源比对小鼠、人、鸡等物种Hoxc10基因序列，设计一对简并引物，序列如下：

上游引物F: 5’-TGTCTCTCAACACCTACCCATC-3’;

下游引物R: 5’- GTTCTCCCK(G/T)GTTCATTTTCT -3’ ,

基因克隆获得多疣壁虎Hoxc10的EST序列。

步骤2）、多疣壁虎Hoxc10全长序列获得

RACE法获得多疣壁虎Hoxc10 的5’cDNA和3’cDNA 序列，与EST序列拼接后得到多疣壁虎Hoxc10全长序列，共包含2156bp,其ORF区位于112-1242bp，共编码376个氨基酸。经生物学相关分析确认为多疣壁虎Hoxc10基因。GenBank登陆号：GQ267528.1

步骤3）、使用DNA STAR软件和SWISS-PLOT在线预测多疣壁虎Hoxc10抗原表位，通过综合分析发现Hoxc10抗原表位极有可能位于氨基酸4-6,21-24,27,29-30,36-42,45,57,72-73,78-81,83-85,99,

131-132, 136,147-149,153-154,162-165,205-206,209,211,216-217, 226,233-234, 240-241,271-274,295,301-302,308-310,337,370,372-373。

本专利选取含有预测抗原表位较多的96-191片段为免疫肽段(对应397-684核苷酸序列)。

步骤4）、构建Hoxc10的原核表达载体

1.设计构建Hoxc10原核表达载体的引物，上游引物5’端加上XhoⅠ酶切位点及其保护碱基和补充碱基使其不出现移码，序列为：