[发明专利]含蛋白标签的SUMO融合蛋白及其应用

权利要求书

1.一种如下所示的融合蛋白：

Tag-SUMO

其中，Tag表示蛋白标签，选自Avi标签、SNAP标签和Halo标签，

SUMO即类泛素化小蛋白；

所述融合蛋白具有SUMO化能力。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，如下所示：

Tag-L-SUMO

其中，L表示柔性连接肽。

3.如权利要求2所述的融合蛋白，L是9个氨基酸的柔性连接肽，例如SSGLVPRGS所示的柔性连接肽。

4.如权利要求1所述的融合蛋白，所述SUMO是人类SUMO1的成熟形式。

5.一种核酸分子，选自编码权利要求1-4中任一项所述融合蛋白的核酸分子或其互补链。

6.一种载体，加载了权利要求5所述的核酸分子，优选表达载体，例如原核生物载体和哺乳动物表达载体。

7.一种在体外SUMO化修饰体系中检测SUMO化的方法，包括：

在体外SUMO化修饰体系中，将被检测蛋白与权利要求1-4中任一项所述的

融合蛋白接触，

检测被检测蛋白的SUMO化产物。

8.一种体外检测SUMO化的系统，包含权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白，纯化的Ub1激活酶(E1)，Ub1转移酶(E2)和Ubc9，以及SUMO化反应缓冲液，所述系统优选试剂盒形式。

9.一种细胞内检测SUMO化的方法，包括：

(1)用编码权利要求1-4中任一项所述融合蛋白的核酸分子转染宿主细胞；

(2)培养宿主细胞，获得蛋白表达；

(3)裂解细胞；

(4)检测被检测蛋白的SUMO化产物。

10.如权利要求9所述的方法，其中，步骤1)还包括用编码Ubc9的核酸分子转染宿主细胞。

11.如权利要求9所述的方法，其中，步骤1)还包括用编码待检测蛋白的核酸分子转染宿主细胞。

12.如权利要求9所述的方法，其中，还包括在步骤4)之前通过免疫沉淀或亲和层析步骤处理步骤3)所得细胞裂解物。

13.如权利要求9所述的方法，包括：

(1).将被检测蛋白的ORF装载到表达载体中，所述载体优选M11，

(2).将步骤(1)制备的载体、权利要求1-4中任一项所述融合蛋白的表达载体和Ubc9的表达载体一同转染到宿主细胞中，优选Hela细胞，所述融合蛋白优选SNAP-L-SUMO或Halo-L-SUMO融合蛋白，

(3).培养细胞，获得各蛋白的表达，

(4).收细胞后检测被检测蛋白的SUMO化产物，例如用WesternBlot法、电泳、免疫荧光或其组合来检测。

14.一种细胞内检测SUMO化的系统，包含：编码权利要求1-4中任一项所述融合蛋白的表达质粒，和转染试剂，，优选试剂盒形式。

15.如权利要求14所述细胞内检测SUMO化的系统，还包含编码Ubc9的表达质粒。

16.如权利要求14所述细胞内检测SUMO化的系统，所述融合蛋白是SNAP-L-SUMO或Halo-L-SUMO融合蛋白。

17.一种筛选SUMO化蛋白底物的方法，

提供作为SUMO化底物的候选蛋白，例如在高置信条件下用预测蛋白的被SUMO化能力的分析软件筛选作为SUMO化底物的候选蛋白，

检测候选蛋白的SUMO化，所述检测采用权利要求7所述体外SUMO化修饰体系中检测SUMO化的方法，或者采用权利要求9至13中任一项所述细胞内检测SUMO化的方法，或者两者的联用，

若检测到候选蛋白的SUMO化产物，表明候选蛋白是SUMO化蛋白底物。

18.一种检测细胞内SUMO修饰的靶蛋白的方法，包括：

(1)在细胞内重组表达权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白；

(2)将细胞裂解液与结合、优选共价结合所述融合蛋白中标签的载体接触，所述载体例如微载体，例如珠粒；

(3)分析与载体接触的靶蛋白信息，例如WesternBlot或者MS分析。