[发明专利]一种去离子甲酰胺的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及法医遗传学及分子生物学领域。特别涉及一种去离子甲酰胺的制备方法。

背景技术

很多分子生物学DNA检测技术需要对样品DNA需要进行变性处理，即使DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为单链结构。凡能破坏双螺旋稳定性的因素都可以成为变性的条件，如加热、极端的pH、有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等，均可破坏双螺旋结构引起核酸分子变性。甲酰胺作为一种变性剂被广泛用于核酸杂交和核酸变性，如Southern，Northern，Slot blot分析，YAC筛选等，法医DNA检测中需要使用甲酰胺对样品DNA进行变性处理，以保持DNA的单链状态，便于后续毛细管电泳检测。能够满足上述应用的甲酰胺必须高度去离子化以及具备较高的纯度(无污染物)，因此甲酰胺的质量非常重要，务必使用电导率小于100μS/cm的去离子甲酰胺。电导率大于100μS/cm的甲酰胺含有离子，在进样时与DNA竞争，这会导致低的峰值，降低灵敏度。延长进样时间不能提高信号强度。

离子交换树脂是带有官能团(有交换离子的活性基团)、具有网状结构、不溶性的高分子化合物。通常是球形颗粒物。离子交换树脂的全名称由分类名称、骨架(或基因)名称、基本名称组成。孔隙结构分凝胶型和大孔型两种，凡具有物理孔结构的称大孔型树脂，在全名称前加“大孔”。分类属酸性的应在名称前加“阳”，分类属碱性的，在名称前加“阴”。如：大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂。树脂中化学活性基团的种类决定了树脂的主要性质和类别。

离子交换树脂首先区分为阳离子树脂和阴离子树脂两大类。阳离子树脂又分为强酸性和弱酸性两类，阴离子树脂又分为强碱性和弱碱性两类(或再分出中强酸和中强碱性类)。

离子交换树脂通常制成珠状的小颗粒，它的尺寸也很重要。树脂颗粒较细者，反应速度较大，但细颗粒对液体通过的阻力较大，需要较高的工作压力；特别是浓糖液粘度高，这种影响更显著。因此，树脂颗粒的大小应选择适当。如果树脂粒径在0.2mm(约为70目)以下，会明显增大流体通过的阻力，降低流量和生产能力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种去离子甲酰胺的制备方法。

本发明的提供去离子甲酰胺的制备方法，包括如下步骤：

(1)将甲酰胺与离子交换树脂混合，得到混合液；

(2)将上述步骤(1)中得到的混合液混合均匀，再将混合液通过过滤器去除离子交换树脂，收集滤液，得到所述去离子甲酰胺。

步骤(1)中，所述甲酰胺与离子交换树脂的配比为(100-500)ml∶(2-8)g，优选为甲酰胺∶离子交换树脂为100ml∶5g。

步骤(2)中，所述混合均匀通过搅拌进行。

上述搅拌是通过磁力搅拌器进行的；所述搅拌的搅拌时间为45分钟-120分钟，优选为45-60分钟；所述磁力搅拌器的转速为400-800rpm，优选是600rpm；

上述搅拌时间为如下1)或2)所述：

1)步骤(1)中甲酰胺的pH小于7.0，搅拌时间为45分钟；

2)步骤(1)中甲酰胺的pH大于7.0，搅拌时间为60分钟。

步骤(2)中，所述混合均匀通过震荡进行。

上述震荡步骤的震荡时间为2-7小时，优选为3小时。

上述离子交换树脂为阳离子交换树脂或阴离子交换树脂；所述离子交换树脂优选是经过冷冻脱水处理的离子交换树脂；所述离子交换树脂为AG501-X8树脂和/或MB-3树脂；所述离子交换树脂的交联度为5％。

上述过滤器为Whatman过滤器、Millipore过滤器或尼龙过滤器，所述过滤器的孔径优选为0.22um。

上述制备方法得到的去离子甲酰胺也属于本发明的保护范围。

经过本发明方法获得的超纯的甲酰胺具有较高的纯度，无RNase和DNase。这使得甲酰胺成分分子生物学领域的一种理想的变性剂。甲酰胺不会引起一些珍贵DNA或RNA样本的降解。甲酰胺必须通过一个混合离子交换树脂进行预过滤以去除残留金属离子或其它降解产物。这个过滤的过程保证了溶液的最终纯度高于99.5％，280nm处吸收值低于0.05。能够使DNA氢键断裂，从而实现DNA变性。

本发明的去离子甲酰胺能够降低核酸的溶解温度使得核酸两条链更容易分离。通常，DNA在双链结构状态下相对比较稳定(即使是在碱基不互补的条件下)，而在单链条件下DNA结构变得不稳定，所以甲酰胺必须增加单链分子的稳定性，即本发明方法中所选用的待去离子的超纯的甲酰胺应具有较高的纯度，且无RNase和DNase。