[发明专利]一种检测RNA病毒hMPV的方法、试剂盒及应用

权利要求书

1.一种利用逆转录等温扩增技术检测RNA病毒hMPV的方法，其特征在于，所述的检测方法包括以下步骤：根据人偏肺病毒的N基因的相对保守区，分别设计了六条引物，包括两条外引物F3、B3和两条内引物FIP、BIP，两条环结合引物LF、LB；处理待测标本，提取样本的RNA后，进行RT-LAMP反应；然后通过电泳检测或肉眼观察，最终得到检测结果；

其中，所述的引物的核苷酸序列为：

外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，或由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；，

外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，或由SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列：

内引物FIP(F1c+F2)的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，或由SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列：

内引物BIP(B1c+B2)的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，或由SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列：

环引物LF的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，或由SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列：

环引物LB的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，或由SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的利用逆转录等温扩增技术检测RNA病毒hMPV的方法，其特征在于，所述RT-LAMP的反应体系为：

Bst DNA聚合酶缓冲液(10×)，2.5μl；

BstDNA聚合酶(8u/μl)，1μl；

AMV反转录酶(10u/μl)，1μl；

dNTP(10mM)，2.5μl；

Betaine(25mM)，1μl；

MgCl₂(150mM)，1μl；

外引物F3、B3(5μM)，各1μl；

内引物FIP、BIP(10μM)，各1μl；

环引物LF、LB(20μM)，各1μl；

DNA，1μl；

ddH₂O，9μl；

总体积25μl。

3.根据权利要求1所述的利用逆转录等温扩增技术检测RNA病毒hMPV的方法，其特征在于，所述RT-LAMP的反应条件为60～68℃恒温反应1～2h，优选65℃恒温1.5h；然后75～85℃灭活3～10min，优选80℃灭活5min。

4.根据权利要求1所述的利用逆转录等温扩增技术检测RNA病毒hMPV的方法，其特征在于，所述提取样本RNA的方法为：以hMPV阳性RNA核酸为模板，使用两步法反转录试剂盒先进行第一步反转录以获取cDNA；以cDNA为模板并RT-PCR引物进行PCR反应，扩增条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸35s，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存；

其中，RT-PCR引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，或由SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；

RT-PCR引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，或由SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列。

5.根据权利要求1所述的利用逆转录等温扩增技术检测RNA病毒hMPV的方法，其特征在于，所述的电泳采用1％琼脂糖凝胶电泳，阳性结果在416bp处产生条带。

6.根据权利要求1所述的利用逆转录等温扩增技术检测RNA病毒hMPV的方法，其特征在于，采用肉眼检测，浑浊有白色沉淀的为阳性，清亮透明的为阴性。

7.根据权利要求1所述的利用逆转录等温扩增技术检测RNA病毒hMPV的方法，其特征在于，采用肉眼检测，在RT-LAMP的反应体系加入羟基萘酚兰，阳性反应呈蓝色，阴性反应呈紫色。

8.一种检测检测RNA病毒hMPV的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括病毒RNA提取试剂盒、RT-LAMP的反应体系、定量参考品、阴性质控品、阳性质控品。