[发明专利]合欢皮中抗肿瘤新生血管活性组分总皂苷的一种测定方法

说明书

技术领域

利用HPLC检测合欢皮中抗肿瘤新生血管活性总皂苷的含量。本发明涉及从中药合欢皮中提取、水解总皂苷为齐墩果酸和HPLC检测齐墩果酸含量，以齐墩果酸含量代表总皂苷含量，并且以齐墩果酸的含量为指标，采用L₉(3⁴)正交试验，考察酸的用量、水解时间、酸的浓度、水解温度四个因素对水解程度的影响，确定合欢皮中抗肿瘤新生血管活性总皂苷的最佳水解条件。 

背景技术

HPLC(High-performance liquid chromatography(or high-pressure liquid chromatography))，即高压液相色谱法，是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送(最高输送压力可达4.9×10⁷Pa)：色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱(每米塔板数可达几万或几十万)；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。其具有高压、高速、高效和高灵敏度等特点，与经典液相色谱相比具有以下优点：检测速度快，分辨率高，灵敏度高，柱子可反复使用，样品量少，容易回收等，并且最新的药典也要求对于合欢皮中皂苷类物质的检测必须使用HPLC，取代了之前的紫外分光光度法。 

正交试验设计(Orthogonal experimental design)是研究多因素多水平的又一种设计方法，它是根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备了“均匀分散，齐整可比”的特点，正交试验设计是分式析因设计的主要方法。是一种高效率、快速、经济的实验设计方法，正交实验设计在很多领域的研究中已经得到广泛应用。本研究采用了四因素三水平的正交实验，以齐墩果酸的含量为考察指标，确定最优的水解工艺路线。 

目前，从合欢皮植物中分离得到的皂苷的结构类型均为五环三萜类齐墩果烷型衍生物，且大多数具有3、16、21位羟基和28位羧基，皂苷多是苷元与几个单糖分子，最多的为10个单糖，以及二分子单萜烯酸(辛二烯酸衍生物)相结合。糖苷有单糖链，双糖链和三糖链，尚未发现在3、16、21及28位同时具有糖链的皂苷。所连接的单糖除常见葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、呋糖外还有少见的鸡纳糖及2-去氧-2-乙酰氨基葡萄糖。而从文献查阅可知，可以利用一定浓度的酸将齐墩果酸与单糖连接的酯键水解，从而得到苷元齐墩果酸[1、蔚冬红，乔善义，赵毅民.中药合欢皮研究概况.中国中药杂志.2004，29(7)：6196-6201] 

合欢皮是合欢树的树皮，是我们常用的传统中药，具有解郁安神、活血消肿之功效[2、国家药典委员会。中国药典第一部，中国医药科技出版社，北京，pp34]。现阶段，人们对合欢皮不同化学组分进行药理学研究，发现合欢皮有抗肿瘤作用：其茎皮醇提取液中能有效地抑制血管内皮细胞，体外具有较强的肿瘤细胞毒活性。在以抗肿瘤新生血管的生理活性指标下，分离纯化得到了合欢皮提取物，定性鉴别分析确定了该活性组分群为皂苷类化合物。前期实验成果已经表明合欢皮中总皂苷为齐墩果烷型皂苷[3、李海涛，徐东铭，吕刚.合欢皮中三萜皂苷类化学成分的研究.长春中医药大学学报.2006，03(1)：62-64]，而我们实验室分离得到了单体合欢皂甙julibroside J₈[4、Hui Hua，Lei Feng，Lian-fen Zhang and Jian Jin.Anti-angiogenic activity of julibroside J₈，anatural product isolated from Albizia julibrissin.2009，16(8)：703-711]。有报道称可以通过酸水解将总皂苷水解成苷元，即齐墩果酸[5、李梦.HPLC法测定女贞子中齐墩果酸的含量.安徽农业科学，2008，36(24)：10519-10526.6、刘成红，魏萍，张淑兰.高效液相色谱法测定山茱萸中马钱苷的含量.解放军药学学报，2007，21(2)：144]。由于目前尚未有通过国家鉴定的合欢皮总皂苷标准品，本实验选用齐墩果酸为参 照标准品，通过酸水解合欢皮中抗肿瘤新生血管活性总皂苷，得到齐墩果酸苷元，建立合欢皮中抗肿瘤新生血管活性总皂苷的HPLC含量测定方法，以齐墩果酸的含量标定总皂苷的含量，同时对该方法进行可行性分析。 

发明内容

本发明的目的是发明建立合欢皮中抗肿瘤新生血管活性总皂苷的一种测定方法。 

本发明的技术方案：