[发明专利]靶向肝细胞的RNA适配子及其核苷酸序列

说明书

技术领域

本发明属肝脏疾病的诊断与治疗领域。本发明涉及利用SELEX技术筛选获得的一种靶向肝细胞的RNA适配子，以及此适配子的核苷酸序列。

背景技术

慢性肝脏疾病是一种重要而难治的疾病。对于病毒性肝炎、肝硬化和肝癌等疾病通常需要长期用药治疗，但大多数药物并非特异性作用于肝脏。将药物与肝脏靶向性载体结合，使其选择性靶向到特定的肝细胞，从而使药物更高效地传递到肝脏、更好地发挥药物的治疗作用是极具前景的治疗方案。但是，目前仍然缺乏特异性的靶向肝细胞的载体。

肝细胞特异性去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor，ASGPR)是肝脏靶向治疗众多作用靶点中研究最多且最有希望的一个靶点。ASGPR是数量丰富的一种异源低聚物的内吞受体，主要存在于肝脏实质细胞朝向窦状隙一侧的细胞膜表面，又称为肝糖凝集蛋白或肝凝集素。ASGPR在基因靶向递送、靶向药物的研究、临床检测等方面具备很高的应用价值。

SELEX技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)是20世纪90年代初-发展起来的一种新的组合化学技术。它利用大容量的随机寡核苷酸库与靶分子相互作用，从中筛选出与靶分子特异结合的寡核苷酸，并结合PCR体外扩增技术，使其得到指数级富集，经过多轮筛选，最终获得高亲和力、高特异性的寡核苷酸适配子。相对于传统意义上的蛋白质抗体分子，经SELEX筛选得到的寡核苷酸适配子分子更小，免疫原性低，能更快渗入细胞，是极具潜力的预防、诊断和治疗疾病的新型试剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种RNA适配子，通过特异性结合肝脏去唾液酸糖蛋白受体来实现肝细胞靶向性，可用于肝脏疾病的诊断与治疗。

本发明通过以下技术方案实现：

体外合成一个长度为115核苷酸的含有25个随机序列的单链DNA文库，通过体外转录构建出单链RNA适配子随机文库；采用亲和柱层析的方法，从人肝组织中纯化肝脏ASGPR，以其大亚基H1作为靶蛋白，采用SELEX技术筛选具有高亲和力的ASGPR特异性RNA适配子；通过结构预测软件RNA Structure Program分析预测适配子的二级结构；通过膜结合测定实验、凝胶阻滞实验鉴定筛选适配子对靶蛋白的特异性和亲和力，得到了一个与H1蛋白亲和力高、特异性强的适配子，命名为H1-A25；该RNA适配子的RNA序列为：5’-GUUGAUUGCGUGUCAAUCAUGGCGUAGUAAAAGACAAGUAGCUACGAGGUCAUGUGUAUGUUGGGGAUUAGGACCUGAUUGAGUUCAGCCCACAUAC-3’，能形成茎环结构。该适配子能特异性高亲和力结合肝脏去唾液酸糖蛋白受体大亚基H1蛋白或能特异性高亲和力靶向结合至肝细胞。制备抗RNA酶降解的氟修饰H1-A25，对其进行绿色荧光标记，鉴定其与肝细胞的特异性结合和内吞，结果发现该适配子能通过ASGPR特异性靶向结合至肝细胞并被细胞内吞，而不结合非肝细胞。

本发明的优点是：

1.获得了能够靶向性结合至肝细胞并被内吞的适配子，该适配子可以大量人工制备，方法简单，成本低廉。

2.为进一步筛选以RNA适配子为基础的肝脏疾病诊断和治疗药物奠定了基础。

附图说明

图1：是SELEX筛选H1蛋白特异性结合RNA适配子的流程图。

图2：是筛选获得的RNA适配子的二级结构分析图。其中图2红色方框内为适配子的随机序列区域，该区域形成了一个特殊的茎环结构。

图3：说明了适配子H1-A25能够特异性高亲和力结合ASGPR大亚基H1蛋白的结果图。

其中图3A部分为适配子H1-A25与H1蛋白的结合曲线，显示了二者之间结合的高亲和力；B和C两部分分别为适配子H1-A25与H1蛋白结合的膜结合实验和凝胶阻滞实验，显示了二者之间结合的高特异性。

图4：说明了适配子H1-A25能够通过ASGPR特异性靶向结合至肝细胞并被细胞内吞的结果图。其中图4A、B和C三部分分别为荧光标记适配子H1-A25与HepG2、Huh7和HeLa细胞进行的结合实验，结果显示H1-A25能够特异性结合肝细胞；D和E部分分别为用ASGPR抗体和过量未标记适配子来阻断适配子与HepG2细胞之间的结合，结果显示H1-A25与肝细胞之间的结合是通过ASGPR来介导的；F部分为活的HepG2细胞对H1-A25的内吞实验，结果显示了H1-A25能够被肝细胞内吞。

具体实施方式