[发明专利]NBS Profiling鉴定植物杂交后代杂种性、物种起源的方法

权利要求书

1.NBS Profiling鉴定植物杂交后代杂种性、物种起源的方法，按以下步骤进行：

（1）供DNA提取的幼叶的采集与保存；

（2）总DNA的分离纯化；

（3）进行酶切反应，对酶切反应产物进行检测，DNA限制性酶消解和末端受体连接；

（4）NBS Profiling 扩增，包括两步PCR反应；

（5）扩增片段的聚丙烯酰胺胶分析和植物杂交后代杂种性、物种起源的判定。

2.根据权利要求1所述的NBS Profiling鉴定植物杂交后代杂种性、物种起源的方法，其特征在于：

所述的（1）供DNA提取的幼叶的采集与保存是采集待鉴定的杂交亲本及其杂交后代、或品种及其潜在亲本的幼嫩叶片，立即放入液氮中将其快速冷冻，随后转移到-18℃～-80℃低温下贮存供DNA分离提取；

所述的（2）总DNA的分离纯化是采用常用的Fulton法或CTAB法提取幼嫩植物组织的DNA，用0.8%～1.5%琼脂糖电泳和紫外检测DNA的浓度和纯度，DNA浓度达到100 ng/μl 以上，DNA纯度OD_260/280值介于1.8～2.0之间，所提取的DNA贮藏于-20℃冰箱，于反应前取部分稀释用于NBS Profiing鉴定；

所述的（3）进行酶切反应，对酶切反应产物进行检测，DNA限制性酶消解和末端受体连接是①酶切反应是取步骤（2）获得的植物总DNA，用RsaI或MseI四碱基识别位点的限制性内切酶将其切割为DNA片段，酶切反应于37℃恒温条件下反应4h-6h或过夜，将反应板置于65℃水浴锅中10min～20min中止反应；②酶切反应产物检测是采用0.8%-1.5%琼脂糖电泳检测酶切反应产物，选择能够把植物总DNA切割成不同长度、连续分散的DNA片段的内切酶，用于下一步酶切、末端受体连接反应；③DNA限制性酶消解和末端受体连接是在使用限制性内切酶切割总DNA的同时，将一个末端受体连接到新产生的DNA末端上，末端受体分为平端受体和MseI特异的受体两种；所述的平端受体的碱基序列为：

5’ A C T C G A T T C T C A A C C C G A A A G T A T A G A T C C C A      3’

                            3’ NH₂  T T C A T A T C T A G G G T    5’-P

所述的MseI特异的受体的碱基序列为：

5’ A C T C G A T T C T C A A C C C G A A A G T A T A G A T C C C A     3’

3’ NH2- T T C A T A T C T A G G G T A T  5’

酶切和受体连接的反应体系：60 μl总体系中有5x AFLP 缓冲液12 μl + 末端受体3 μl + 蒸馏水36 μl + ATP（10 mM）6 μl + 限制性酶1 μl + T4连接酶（5 U/μl） 1 μl + DNA（100 ng～400 ng） 1 μl，酶在加完所有试剂后最后一步加入；

酶切和连接反应于37℃恒温条件下反应4h-6h或过夜，将反应板置于65℃水浴锅中10min～20min中止反应，反应产物置于4 ^oC或 –20 ^oC冰箱贮藏；加60 μl蒸馏水到所述的酶解-连接反应产物将其稀释一倍后，供下一步的NBS Profiling 扩增反应使用；

所述的（4）NBS Profiling 扩增，包括两步PCR反应是：

①第一次PCR扩增

第一步PCR扩增反应，25 μl反应体系为：步骤（3）稀释的酶解-连接反应产物5 μl + NBS特异引物2 μl + 受体引物（10 pMol/ul）2 μl + dNTP (5mM) 1 μl + 10x PCR 缓冲液2.5μl + DNA Taq 聚合酶 0.08 μl + 蒸馏水12.42 μl；

PCR扩增反应条件为：95℃ 预变性15 min；95℃ 变性30s, 55℃-60℃退火 100s,72℃ 延伸2 min，共30个循环；72℃延伸20min后10℃保存；其中退火温度NBS1、NBS5、NBS6、NBS GLPL引物为 55°C，NBS2、NBS3引物为60°C；

受体引物序列为：

5’ G T T T A C T C G A T T C T C A A C C C G A A A G  3’；

NBS特异引物序列如下：

NBS LPL：5' T G Y R R A G G A Y T R C C W Y T A G C 3' 

NBS 1: 5' G C I A R W G T W G T Y T T I C C Y R A I C C 3' 

NBS 2: 5' G T W G T Y T T I C C Y R A I C C I S S C A T 3' 

NBS 3: 5' G T W G T Y T T I CC Y RA I C C I S S C A T I C C 3' 

NBS 5A: 5' Y Y T K R T H G T M I T K G A T G A T G T I T G G 3' 

NBS 6: 5' Y Y T K R T H G T M I T K GA T G A T A T I T G G 3' ；

②第二次PCR扩增

第二步PCR扩增反应是以步骤（4）①中第一次扩增的PCR产物为DNA模板，加入NBS特异引物和标记受体引物进行PCR反应，10 μl反应体系为：步骤（4）①中第一次扩增的PCR产物5μl + IRD 700标记的受体引物（1 pmol/μl）0.6 μl + NBS特异引物（10 pMol/ul）2 μl + dNTP (5mM) 0.4 μl + 10x PCR 缓冲液1μl + DNA Taq 聚合酶 0.04 μl + 蒸馏水2.66 μl；PCR扩增反应条件除延伸温度由100s减为40s，PCR循环减为20个循环外，其余与第一次PCR反应条件相同；

所述的（5）扩增片段的聚丙烯酰胺胶分析是将步骤（4）②中标记的PCR产物进行聚丙烯酰胺胶电泳分离，加入0.5~1.5倍体积的溴酚蓝上样缓冲液到步骤（4）②中标记的第二次PCR产物中，混匀样品于94°C条件下变性5 min后，立即转移到冰上至加样结束，然后将其保存于4°C或-20°C冰箱；当鉴定植物杂交后代杂种性时，上样按亲本1 - 杂交后代 - 亲本2的顺序排列样品；当鉴定物种起源时，上样按已知亲本或潜在亲本1 - 待鉴定的品种或资源 – 潜在亲本2的顺序排列样品；每一样品的加样量为0.4 μl~0.5 μl；所述的植物杂交后代杂种性、物种起源的判定是如果杂交后代的扩增条带一部分与父本相同、一部分与母本相同，且所有条带都能追溯到杂交亲本中，说明这一杂交后代为真杂种；如果杂交后代的扩增条带与母本的条带完全相同，说明这一杂交后代为自交种；具有待鉴定的品种或资源所有条带的潜在亲本组合是该待鉴定的品种或资源的亲本。