[发明专利]一种农杆菌介导的日本结缕草遗传转化方法

权利要求书

1.一种农杆菌介导的日本结缕草遗传转化方法，其特征在于，包括步骤：

1)当根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的菌液OD₆₀₀值为0.3-0.4时，离心收获菌体，然后向菌体中加入pH值为5.2的AAM-AS培养基悬浮菌体；

2)用悬浮于AAM-AS培养基中的根癌农杆菌侵染日本结缕草的愈伤组织，将侵染后的愈伤组织置于pH值为5.2的N₆D₂-AS培养基中共培养2-3天，最后洗去根癌农杆菌，筛选并培养愈伤组织。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，侵染时间为1.5-2h。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，侵染时间为1.5h。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，共培养时间为2天。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，洗去根癌农杆菌包括步骤：

1)将共培养的愈伤组织用无菌蒸馏水冲洗3-5次，边洗边振荡，直至清洗后的液体澄清；

2)然后将愈伤组织悬浮于含有450-550mg/L头孢霉素和150-250mg/L氨苄青霉素的无菌水中，25-28℃，100-120rpm，1.5-2h。

6.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述根癌农杆菌为含有目的基因的转化的根癌农杆菌。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述转化的根癌农杆菌，其出发菌株为EHA105。

8.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，日本结缕草的愈伤组织的制备方法为：将日本结缕草种子浸于次氯酸钠溶液中在磁力搅拌器上消毒，将消毒后的种子用无菌水洗3-5次，4℃下浸泡3-4d；浸泡后的种子再用次氯酸钠溶液消毒15-25min，用无菌水洗3-5次后，吸干种子表面的水分，接种于愈伤组织诱导培养基上，26-30℃黑暗条件下诱导愈伤；愈伤组织每月继代一次，继代时挑选白色或黄色、颗粒状愈伤组织转接到继代培养基上培养，即得；

其中，使用的愈伤组织诱导培养基配方为：NB₀+2，4-D2mg/L，pH5.8；愈伤组织继代培养基配方为：NB₀+2，4-D2mg/L，pH5.8。