[发明专利]甘蓝型油菜BnPABP3启动子的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种分离的启动子P_BnPABP3，其序列为SEQ ID No.1 所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的一种分离的启动子，其特征在于：所述的启动子含有重组载体pBI-P_BnPABP3。

3.权利要求1所述的一种甘蓝型油菜P_BnPABP3启动子的制备方法，其步骤是： 

A、油菜P_BnPABP3启动子引物设计：

利用SDS裂解法提取油菜DNA，按照基因组步移试剂盒操作程序，进行基因组步移，步移进行两轮PCR扩增，克隆获得油菜P_BnPABP3，步移所用引物是：

AP1：5'–GTAATACGACTCACTATAGGGC–3'；GSP1：5'–TTGATCAGCCGCAACCACTGGAGATTG–3'；AP2：5'–ACTATAGGGCACGCGTGGT–3'；GSP2：5'–TGATCAATCATTGTCGACGGTGCAACCC–3'；

B、甘蓝型油菜启动子P_BnPABP3制备是：

根据基因组步移试剂盒说明，取5μl DNA用DraⅠ酶切，检测其纯度，体系如下：DNA 5 μl， DraⅠ1.6μl，10×buffer 2 μl，无菌水补齐至20μl，37℃，过夜，用1％质量体积比琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，分别用产生平末端的限制性内切酶DraI、EcoRV、PvuII和StuI在100μl体系内酶切2.5μg的基因组DNA，四种限制性内切酶的反应体系如下：DNA 2.5 μg ， 限制性内切酶 8 μl，10×buffer 10 μl，无菌水补齐至100 μl，37℃过夜，酶切完成后纯化，纯化步骤如下：向酶切液中加入10μl 的3M NaOAc和50 μl 的95%体积比乙醇， - 20℃下沉淀3小时，然后12000rpm离心15 分钟，70%体积比乙醇洗涤两遍，12000 rpm离心5 分钟，室温下晾干，用20 μl无菌水溶解，纯化完成后加入特异性接头，反应体系如下：10×T4 ligase buffer 2.0 μl，上述酶切处理的DNA 8.0 μl， T4 ligase 1 μl，特异性接头 14.0 μl，无菌水补至 20 μl，16℃过夜，将连接液用双蒸水稀释10倍，保存于-20℃，建立了四个经限制性内切酶处理并连有特异性接头的DNA库，以其为模板进行两轮PCR反应，第一轮PCR反应以GSP1和AP1为引物，体系如下：10×buffer 5 μl，dNTPs mixture 1.0 μl，GSP1 2.5 μl，AP1 2.5 μl，Taq 酶 0.2 μl，稀释的DNA库0.1μl，无菌水补至50μl，反应程序如下：94℃ 1min；98℃ 10s ，72℃ 2min，共7个循环；98℃ 10s，68℃ 2min，共 33个循环；72℃ 10min，第二轮PCR以第一轮PCR反应产物50倍稀释液做为模板，以GSP2和AP2为引物进行扩增，反应体系如下：10×buffer 5μl，dNTPs mixture 1.0 μl，GSP2 2.5 μl，AP2 2.5 μl，Taq 酶 0.2 μl，稀释模板溶液 1.0 μl，无菌水补至50 μl，反应程序同第一轮PCR，完成后回收纯化第二轮PCR产物，并与T载体连接，经测序获得P_BnPABP3全长序列。

4.权利要求书1所述的一种分离的启动子P_BnPABP3在花药中的应用。

5.权利要求书1所述的一种分离的启动子P_BnPABP3在花粉粒中的应用。