[发明专利]具有双重筛选标记的多形汉逊酵母菌及其应用

权利要求书

1.尿嘧啶合成和色氨酸合成双缺陷型多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HUT-31，其保藏号为CGMCC No.4778。

2.一种尿嘧啶合成和色氨酸合成双缺陷型基因工程酵母菌，为将尿嘧啶合成缺陷型酵母菌中的5-磷酸核糖氨基苯甲酸异构酶编码基因的功能丧失，得到的重组菌即为尿嘧啶合成和色氨酸合成双缺陷型基因工程酵母菌。

3.根据权利要求2所述的基因工程酵母菌，其特征在于：

所述将尿嘧啶合成缺陷型酵母菌中的5-磷酸核糖氨基苯甲酸异构酶编码基因的功能丧失是通过同源重组实现的；

所述尿嘧啶合成缺陷型酵母菌为多型汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-11CGMCC No.1218。

4.根据权利要求2或3所述的基因工程酵母菌，其特征在于：所述同源重组的方法包括如下步骤：向多型汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-11中导入序列表中序列2所示的DNA。

5.一种表达外源蛋白的试剂盒，包括权利要求1所述的多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HUT-31或权利要求2-4中任一所述基因工程酵母菌和酵母表达载体，所述酵母表达载体为如下1)和/或2)所示：

1)满足如下条件的酵母表达载体I：将所述酵母表达载体I转入权利要求1所述的多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HUT-31或权利要求2-4中任一所述基因工程酵母菌后，得到的酵母菌能够合成尿嘧啶；

2)满足如下条件的酵母表达载体II：将所述酵母表达载体II转入权利要求1所述的多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HUT-31或权利要求2-4中任一所述基因工程酵母菌后，得到的酵母菌能够合成色氨酸。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：

所述酵母表达载体I按照如下方法制备：在载体YEp352的多克隆位点上插入由甲醇氧化酶基因启动子MOXp、外源蛋白编码基因和醇氧化酶基因终止子AOX1TT依次连接而成的表达盒得到的酵母表达载体；

所述酵母表达载体II按照如下方法制备：在载体p352HTRP的多克隆位点上插入由甲醇氧化酶基因启动子MOXp、外源蛋白编码基因和醇氧化酶基因终止子AOX1TT依次连接而成的表达盒得到的酵母表达载体；

所述甲醇氧化酶基因启动子MOXp的核苷酸序列如序列表中序列3第1位到1517位所示；

所述醇氧化酶基因终止子AOX1TT的核苷酸序列如序列表中序列3第3286位到3690位所示；

所述载体p352HTRP按照如下方法制备：将序列表中序列1所示的DNA序列插入表达载体YEp352的StuI和NdeI酶切位点得到的重组载体。

7.权利要求1所述的多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HUT-31或权利要求2-4中任一所述基因工程酵母菌在表达外源蛋白中的应用；或权利要求5所述试剂盒在表达外源蛋白中的应用。

8.一种表达外源蛋白的方法，包括如下步骤：

1)将外源蛋白的编码基因通过酵母表达载体导入权利要求1所述的多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HUT-31或权利要求2-4中任一所述基因工程酵母菌中，得到重组酵母菌；

2)用筛选培养基培养所述重组酵母菌，得到存活的重组酵母菌；

3)培养所述存活的重组酵母菌，得到所述外源蛋白；

所述步骤1)中的酵母表达载体为酵母表达载体I时，所述步骤2)中的筛选培养基为培养酵母菌的培养基，且其中不含有尿嘧啶但含有色氨酸；

所述步骤1)中的酵母表达载体为酵母表达载体II时，所述步骤2)中的筛选培养基为培养酵母菌的培养基，且其中不含有色氨酸但含有尿嘧啶；

所述步骤1)中的酵母表达载体为酵母表达载体I和酵母表达载体II时，所述步骤2)中的筛选培养基为培养酵母菌的培养基，且其中不含有色氨酸也不含有尿嘧啶。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述培养酵母菌的培养基为酵母菌基本培养基YNB。

10.一种DNA分子，其核苷酸序列如序列表中序列2所示。