[发明专利]与猪血液参数性状相关的microRNA分子标记及应用

说明书

技术领域

本发明属于家畜基因工程技术领域，具体涉及一种作为猪标记辅助选择的与血液参数(免疫)性状相关的microRNA分子标记的克隆及应用。 

背景技术

MicroRNAs(miRNAs)为一类大小约22个碱基通过与其靶mRNA结合而诱导转录后基因沉默的小RNA(Bartel et al.，2004；Kim et al.，2005)。哺乳动物中miRNA的加工过程可分为多步。起先，大部分miRNA通过RNA聚合酶II(RNA polymerase II)转录成一条长的原初转录物(pri-miRNA)(Lee et al.，2004)，随后，pri-miRNA被由III型RNA核酸酶Drosha和双链RNA结合蛋白DGCR8组成的微处理复合体切割成大小为70～80nt的前体miRNA(pre-miRNA)(Lee et al.，2003；Gregory et al.，2004；Denli et al.，2004)。接着由核输出蛋白Exportin-5及协同作用因子Ran-GTP一起将发夹前体miRNA转运出核(Yi et al.，2003；Lund et al.，2004；Bohnsack et al.，2004)。在细胞质中，前体miRNA被另一个III型RNA核酸酶Dicer切割形成双链miRNA复合体。随后解旋，其中一条成为成熟miRNA进入核糖蛋白复合体，形成RNA干扰沉默复合体(RISC)(Preall et al.，2005)。在RISC中，miRNA通过两种方式调节靶基因的表达，如果其与靶基因3′UTR完全互补，则使其降解；若不完全互补结合，则阻碍其翻译。 

体内miRNA的生物合成受到严密的调控，存在于pri-miRNA、pre-miRNA及成熟miRNA序列上的突变会不同程度地影响最终成熟miRNA的生成。在哺乳动物中，miRNA作为内源性阻遏物，通过结合靶mRNA的3′UTR区阻遏编码基因的翻译。由于在靶位点序列上存在的SNP可影响miRNA的调控作用，靶位点自然产生的SNP是miRNA功能研究的重点对象(Saunders，et al.2007)。 

近年来越来越多的研究发现，编码合成人类miRNA的基因(包括miRNA原始转录本pri-miRNA，miRNA前体pre-miRNA和成熟miRNA)以及miRNA的靶基因结合序列内也存在SNP(Duan，et al.2007)。Duan等研究has-miR-125a基因时发现，该基因位点也存在SNP，从而含miR-125a-G和miR-125a-U两种等位的miR-125a，其中miR-125a-U能显著影响DGCR8与pri-miRNA-125a的结合和剪接，使成熟的miR-125a生成减少，使miR-125a对靶基因Lin-28的翻译抑制作用减弱(Duan，et al.2007)。Sethupathy等研究发现，位于AGTR1基因has-miR-155结合位点下游的SNP(rs5186)可影响与has-miR-155的结合，has-miR-155对该位点为A等位的AGTR1 mRNA的结合能力增强，对AGTRI基因表达的下调作用更明显，而该位点为C等位的AGTR1 mRNA表达不受has-miR-155影响(Sethupathy，et al.，2007)。 

miRNA在免疫调节中的扮演十分重要的角色，相比于损伤相关分子模式的microRNA，miR-155是与病原相关分子模式相关的miRNA(Hideho Okada，2010)，而且miR-155作为一个原癌基因(Tam et al.，1997)，在多种肿瘤中高表达。miR-155功能广泛，它参与造血、炎症和免疫等许多生物过程(Isabella Faraoni，etal.，2009)。BIC/miR-155在维持免疫系统正常功能及稳态中发挥重要作用(Rodriguez，et al.，2007)。人与小鼠mir-155分别定位于各自基因组的第21号、16号染色体上，均来源于一条非编码长链RNA，BIC(B-cellIntegration Cluster)。BIC最初被鉴定为存在于由禽类白血病病毒诱导的B淋巴细胞癌的一个常见逆转录病毒整合位点上的基因，它可被插入的启动子活性激活转录(Tam et al.，1997)。2005年Eis等发现miR-155由bic RNA经加工剪切而产生，bic共包含三个外显子，而miR-155的前体存在于第三个外显子中(小鼠 miR-155前体起始于第三个外显子的第88nt)(Eis et al.，2005)。