[发明专利]一种克隆类病毒全基因序列的方法

说明书

技术领域

本发明属于类病毒的基因工程领域，涉及一种克隆植物类病毒全基因序列的方法，特别是涉及克隆马铃薯纺锤块茎类病毒属(Pospiviroid)全基因序列的方法。

背景技术

类病毒(viroid)是迄今为止发现的最小病原物，是一类单链共价闭合环状的裸露RNA分子，由246～400个核苷酸组成，是目前已知的最小的能够自我复制的遗传单位，不编码任何蛋白质，因此是一类不同于病毒的低分子致病因子，危害高等植物可造成严重经济损失。目前发现的类病毒有30种，其中有26种属中央保守区、无核酶活性的马铃薯纺锤块茎类病毒科(Pospiviroidae)和4种属无中央保守区、有核酶活性的鳄梨日斑类病毒科(Avsunviroidae)。马铃薯纺锤块茎类病毒科(Pospiviroidae)可分为：马铃薯纺锤块茎类病毒属(Pospiviroid)、苹果锈果类病毒属(Apscaviroid)、锦紫苏类病毒属(Coleviroid)、椰子死亡类病毒属(Cocadviroid)、啤酒花矮化类病毒属(Hostuviroid)等5个属，其中马铃薯纺锤块茎类病毒属(Pospiviroid)为最大的属，有PSTVd、TCDVd、CEVd、TPMVd、MPVd、CSVd、TASVd、IrVd、CLVd等9个种(Flores et al，Annu.Rev.Phytopathol，2005.43：117-139)。Bostan等针对马铃薯纺锤块茎类病毒属的保守序列设计了一对引物能检测其中除CLVd外的8个种(Bostan et al，Journal of Virological Methods，2004，116(2)：189-193)，片段长度因类病毒种不同而不同，都在200bp左右。

目前，根据类病毒环状RNA的特点和RT-PCR克隆存在引物与模板个别碱基错配造成获得的全基因序列不准确的特点，为确保克隆序列的准确性，RT-PCR克隆类病毒全基因序列时多根据已知类病毒基因序列的2个保守区域设计两对重叠部分序列的正方向引物，进行两次RT-PCR克隆，获得2个全长序列，相互验证，去掉引物序列和重复序列，以获得准确的全长序列(Behjatnia et al，Phytopathology，1996，86(8)：880-886)。因此，需要进行两次RT-PCR克隆，既费时，又费试剂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高准确率、一次完成类病毒全基因序列克隆的方法，且能用一对引物克隆马铃薯纺锤块茎类病毒属(Pospiviroid)中的大部分类病毒种的全基因序列。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的。

一种克隆类病毒全基因序列的方法，包括以下步骤：

1)类病毒基因组RNA的获得；

2)以步骤1)得到的类病毒基因组RNA为模板，通过反转录，得到引物之间的目标序列加上至少一个类病毒全基因组序列长度的cDNA；

3)以步骤2)得到的cDNA为模板，进行PCR扩增，回收、纯化PCR产物，克隆、测序；

4)通过比对、分析序列获得类病毒全长基因序列。

一种克隆马铃薯纺锤块茎类病毒属类病毒全基因序列的方法，包括以下步骤：

(1)选择感染马铃薯纺锤块茎类病毒属类病毒的植物植株顶部的幼嫩叶片，SDS-LiCL方法提取植物总RNA和类病毒RNA；

(2)以反向引物5’-AGCTTCAGTTGTTTCCACCGGGT-3’作为RT引物，以步骤(1)提取的基因组RNA为模板，通过反转录获得cDNA产物；

(3)PCR扩增与片段回收

以5’-ATTAATCCCCGGGGAAACCTGGAG-3’为正向引物，5’-AGCTTCAGTTGTTTCCACCGGGT-3’为反向引物，以步骤(2)得到的cDNA为模板，进行PCR扩增；

(4)纯化PCR产物克隆，测序，通过比对、分析序列获得类病毒全长基因序列。

步骤(2)所述的RT反应体系：5×RT buffer：2μl，0.1M的DTT：1μl，100μg/L的RT反向引物：0.5μl，5mM的dNTPs：2μl，RNasin酶：10U，M-MLV RT酶：100U，超纯水补至7.5μl；

反应程序：0.2μg/μl的RNA 2.5μl 65℃变性8min，冰浴3min，加7.5μl的RT-反应体系，42℃水浴至少1h，95℃温浴2min终止反应，获得cDNA产物。