[发明专利]一种体外合成谷胱甘肽的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种体外合成谷胱甘肽的方法，具体涉及一种酶法合成谷胱甘肽的方法。

背景技术

谷胱甘肽(Glutathione，GSH)作为一种生物活性三肽化合物，具有多种重要的生理功能，对于维持生物体内适宜的氧化还原环境至关重要。目前谷胱甘肽的工业应用价值在于，作为生物活性添加剂应用于食品领域，以其抗氧化、防辐射、防衰老等功能应用于医药保健领域，国内外对其商业需求有不断增长的趋势。

目前，谷胱甘肽的生产方法主要有萃取法、化学合成法、发酵法以及酶法。萃取法制备谷胱甘肽工艺落后且产量低；化学合成法成本高、反应步骤多、反应时间长、操作复杂，需光学拆分且存在环境污染等问题；而发酵法制备谷胱甘肽则后处理麻烦且转化效率低，也存在产品从胞内分离难的问题。与前几种方法相比，酶法具有催化专一性强、反应条件温和、转化效率高等优点。

酶法生产谷胱甘肽是利用合成谷胱甘肽所需的关键酶-γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶及谷胱甘肽合成酶催化，同时添加L-谷氨酸、L-半胱氨酸及甘氨酸等底物，并添加少量三磷酸腺苷(ATP)来合成谷胱甘肽。合成反应分为两步，第一步由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-Glutamylcysteine Synthetase，γ-GCS)催化合成中间体γ-谷氨酰半胱氨酸；第二步由谷胱甘肽合成酶(Glutathione Synthetase，GS)催化，在γ-谷氨酰半胱氨酸的半胱氨酸端的羧基与甘氨酸的氨基之间形成肽键，由此得到谷胱甘肽，如下所示：

目前文献中报道的酶法主要是以湿菌体或者固定化微生物细胞作为酶源催化底物反应生成谷胱甘肽。

专利号CN100540650C提供了一种“用酶工程技术生物合成谷胱甘肽的方法”，该专利公开了一种固定化细胞酶工程技术用于谷胱甘肽生产的方法；该方法中采用发明人筛选出的高产谷胱甘肽的酿酒酵母诱变菌(CGMCC No 1917)，通过海藻酸钠包埋法固定化细胞，并以L-谷氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸作为底物，辅以葡萄糖和镁离子制备谷胱甘肽。采用该方法，500mL底物液(20mM)经固定化细胞催化，最终分离纯化后得到0.95g谷胱甘肽粉末，收率31％。该方法工艺稳定、产品后处理简单；缺点在于胞膜及细胞壁造成的酶与底物间的传质障碍导致胞内相关酶无法被充分利用，谷胱甘肽合成效率较低。

专利申请CN200510122930.5提供了“一种促进微生物酶法合成谷胱甘肽的方法”，其中公开了一种利用微生物细胞进行酶法合成谷胱甘肽的技术。该方法通过构建培养重组大肠杆菌E.coli WSH-KE1细胞作为酶源，并在反应体系中直接添加低浓度的有机溶剂或表面活性剂，降低细胞外膜的通透性屏障，在三磷酸腺苷(ATP)存在下催化L-谷氨酸、L-半胱氨酸及甘氨酸合成谷胱甘肽，反应2小时谷胱甘肽合成量可达4.8g/L。细胞通透剂的加入可以显著提高微生物体内相关酶的利用率，但是会造成关键酶随底物的流失，导致固定化细胞可重复用作反应催化剂这一优势减弱。此外，反应体系中需要添加大量ATP，ATP价格较昂贵，因此该方法用于工业生产的可行性不高。

丁燏等在“南极硅藻GJ01谷胱甘肽合成酶法生产谷胱甘肽”(中国水产科学，14卷5期829-835页，2007年公开)一文中，发表了一种利用南极硅藻GJ01细胞粗酶提取液中谷胱甘肽的合成酶系，并在反应底物液中添加丙酮处理的南极硅藻GJ01细胞以供应少量ATP，在30℃、pH7.5反应条件下进行谷胱甘肽合成反应。因南极硅藻合成酶系自身的酶活局限性，采用此方法的5L体系8mM底物浓度下谷胱甘肽产量仅为0.702g/L，转化率仅有22.87％。

沈立新等在“固定化E.coli BL21(pTrc-gsh)细胞催化合成谷胱甘肽”(华东理工大学学报，28卷1期24-28页，2002年公开)一文中，发表了一种将重组大肠杆菌与酿酒酵母细胞共固定化体系，在填充床中反应，GSH合成量达1.24g/L。该体系中酿酒酵母的糖酵解途径可以为谷胱甘肽合成反应提供能量物质，且可利用自身的GSH合成酶合成少量GSH。该体系的缺陷依然是多重细胞膜(及细胞壁)造成的酶与底物间的传质障碍。