[发明专利]基于基因沉默技术的灰飞虱致死基因片段Chitinase及其dsRNA

说明书

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，涉及基于基因沉默技术的灰飞虱致死基因片段Chitinase及其dsRNA。

背景技术

在我国，化学药剂连续单一长期使用已导致灰飞虱对多种农药产生了不同程度的抗性，需要不断加大农药使用量才能达到满意的防治效果，造成了更为严重的环境污染，形成恶性循环。另外灰飞虱传播条纹病毒引起的水稻条纹叶枯病，发病后药剂控制效果较差，只能依靠治虫防病。因此，在农业生产实践中，急需化学农药之外的替代防治手段。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一种由双链RNA介导的基因沉默现象，双链RNA最终被加工大小约为22nt的小RNA(siRNA)，通过序列配对的方式与蛋白编码基因结合，根据序列配对的程度降解靶标基因mRNA或抑制基因的蛋白翻译过程。RNAi广泛地存在于真菌、植物和动物中。2006年Andre Fire和Craig Mello因发现RNAi现象被授予诺贝尔医学与生理奖。

在生物体中，一些重要的基因对维持生命是必须的。因此，从理论上而言，如果利用RNA干扰技术将农业害虫中重要基因的表达进行干扰，则会引起害虫的致畸或致死，从而达到控制害虫的目的。本专利发明就是利用实验室改进的dsRNA喂食法从灰飞虱中筛选出经干扰后能够导致灰飞虱死亡的重要基因，为建立利用RNA干扰技术控制害虫的新策略提供序列和数据基础。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种灰飞虱致死基因片段Chitinase及其克隆方法。

本发明的另一方法是提供该致死基因片段Chitinase的dsRNA及其合成方法。

本发明的又一目的是提供一种用于筛选致死基因的dsRNA喂食法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

灰飞虱致死基因片段Chitinase，序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的灰飞虱致死基因片段Chitinase的克隆方法，包括如下步骤：

(1)取灰飞虱，提取总RNA，以提取的灰飞虱总RNA合成cDNA第一条链；

(2)以步骤(1)合成的灰飞虱cDNA第一条链为模板，以序列为SEQ ID NO.2的上游引物P1、序列为SEQ ID NO.3的下游引物P2进行RT-PCR扩增；

(3)PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标DNA片段；

(4)将回收的目标DNA片段在T3连接酶作用下插入至pEASY-T3载体中，转化到大肠杆菌T1，涂于含有X-gal、IPTG以及氨苄青霉素的LB培养基，37℃培养，过夜；

(5)通过挑选白色单菌落，筛选阳性重组子；

(6)用含氨苄青霉素的LB培养液将重组子扩增，提取克隆质粒；

(7)全自动序列仪进行测序，得到SEQ ID NO.1所示的Chitinase基因片段。

其中，所述的RT-PCR扩增体系为：反应缓冲液5μL，Mg²⁺4μL，dNTP 4μL，cDNA模板2μL，上游引物P1 1μL，下游引物P2 1μL，R-Tag酶0.5μL，ddH₂O 32.5μL，共50μL；所述的反应程序为：94℃变性2min，94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，35个循环，72℃延伸。

灰飞虱致死基因片段Chitinase的dsRNA，序列如SEQ ID NO.4所示。

所述的灰飞虱致死基因片段Chitinase的dsRNA的合成方法，是以灰飞虱cDNA第一条链为模板，以序列为SEQ ID NO.5的上游引物P3、序列为SEQ ID NO.6的下游引物P4PCR扩增得到灰飞虱致死基因片段Chitinase的dsRNA。

所述的灰飞虱致死基因片段Chitinase的dsRNA的合成方法优选包含如下步骤：

(1)根据已经验证的Chitinase基因片段序列，设计并合成序列为SEQ ID NO.5的引物3和序列为SEQ ID NO.6的引物4，以灰飞虱cDNA第一条链为模板PCR扩增得到灰飞虱致死基因片段Chitinase的dsRNA，PCR体系为：反应缓冲液5μL，Mg²⁺4μL，dNTP 4μL，cDNA模板2μL；上游引物P3 2μL，下游引物P4 2μL，Ex Tap酶0.25μL，ddH₂O 30.75μL，共50μL；PCR条件为：94℃变性2min，94℃30sec，55-62℃30sec，72℃30sec，38个循环，72℃延伸。