[发明专利]一种检测猪链球菌2型胞外蛋白因子和溶血素基因的多重PCR方法

权利要求书

1.一种同时检测猪链球菌2型胞外蛋白因子EF和溶血素基因SLY的多重PCR方法，分别针对猪链球菌2型胞外蛋白因子和溶血素基因设计PCR引物，胞外蛋白因子基因EF的上游引物为：5′-GAAGAAGAACCCAAGGAACC-3′，下游引物为：5′-ACATTCTGACCACTCGCATC-3′，扩增的EF片段大小为158bp；溶血素基因SLY的上游引物为：5′-TTCCGATTTCGTATTCAACC-3′，下游引物为：5′-AACTGTTCTCCACCACTCCC-3′，扩增的SLY片段大小为338bp，引物与Buffer、模板、酶等试剂构成PCR反应体系，PCR仪上进行扩增，本发明用于猪链球菌2型EF和SLY基因的快速、鉴别检测。

2.权利要求1所述的PCR反应体系为25ul体系，按顺序加入以下试剂：

上述操作冰上进行，所有试剂加完后，盖盖，低速离心(1500g×2min)，置PCR仪上进行PCR反应。

3.权利要求1所述的PCR反应条件为：

4.本发明的步骤包括：

(1)冰上操作，按顺序加入一定量的H₂O、Buffer、Mg²⁺、dNTP、引物、模板、酶等，盖盖，低速离心；

(2)将上述25ul的反应体系放到PCR仪上，设定PCR反应程序，进行PCR扩增；

(3)琼脂糖电泳检测：用0.5×的TBE缓冲液配制浓度为2％的琼脂糖凝胶，将凝胶放入电泳槽中，加入电泳液，将电泳样品与溴酚蓝上样缓冲液按5∶1比例混合后将样品依次加入加样孔中。上样量6ul。打开电泳仪，180V恒压电泳，使核酸样品向正极泳动。电泳后置紫外-可见光凝胶成像仪中观察电泳结果；

(4)判定标准：如果电泳检测出现158、338bp的目的条带，则判定为EF和SLY基因检测均为阳性；如果没有目的条带，则判定为阴性。PCR实验需设阳性对照和阴性对照；

本发明方法的灵敏度高(达0.1ng/ul)，检测效率高，通过一个PCR反应即可快速检测出猪链球菌2型的EF、SLY基因。由于PCR仪的普及推广，本发明具有实用性强、检测成本低的优点。