[发明专利]家蚕丝腺细胞合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的方法

权利要求书

1.一种家蚕丝腺细胞合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的方法，其特征在于该方法的步骤如下：

（1）采用分子生物学技术构建家蚕合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的载体pBSer1RVGP-A3EGFP质粒和pBFibLRVGP-A3EGFP质粒； 

（2）采用显微注射转基因家蚕方法将pBSer1RVGP-A3EGFP质粒或pBFibLRVGP-A3EGFP质粒与能够提供转座酶trans的辅助质粒一起导入家蚕受精卵内，蚕卵孵化后饲养至成虫，自交续代为G1代，在G1代转基因家蚕的小蚕期，采用转基因昆虫荧光基因表达相对量无损伤测定方法，观察选择表达EGFP标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫自交续代为G2代，G2代以后均采用蛾区育，成虫自交续代，再经1-3代选种，每代在小蚕期采用转基因昆虫荧光基因表达相对量无损伤测定方法，以表达EGFP标志基因为留种筛选标志，创制家蚕中部丝腺生物反应器和后部丝腺生物反应器，育成中部丝腺细胞、后部丝腺细胞能够特异性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因纯合的转基因家蚕新品种；（3）在中部丝腺细胞能够特异性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因纯合的转基因家蚕新品种的基础上，采用显微注射转基因家蚕方法将pBFibLRVGP-A3EGFP质粒与能够提供转座酶trans的辅助质粒一起导入该家蚕品种受精卵内，在后部丝腺细胞能够特异性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因纯合的转基因家蚕新品种的基础上，采用显微注射转基因家蚕方法将pBSer1RVGP-A3EGFP质粒与能够提供转座酶trans的辅助质粒一起导入该家蚕品种受精卵内，受精卵孵化后饲养至成虫，自交续代为GG1代，在GG1代转基因家蚕的小蚕期，采用转基因昆虫荧光基因表达相对量无损伤测定方法，观察选择表达EGFP标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫自交续代为GG2代，GG2代以后均采用蛾区育，成虫自交续代，再经2代选种，每代在小蚕期采用转基因昆虫荧光基因表达相对量无损伤测定方法，以表达EGFP标志基因为留种筛选标志，创制家蚕丝腺生物反应器，育成中部丝腺细胞、后部丝腺两部分细胞都能够特异性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因纯合的转基因家蚕新品种； 

（4）将中部丝腺细胞能够特异性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因纯合的转基因家蚕新品种，与后部丝腺细胞能够特异性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因纯合的转基因家蚕新品种杂交为F1代，在F1代转基因家蚕的小蚕期，采用转基因昆虫荧光基因表达相对量无损伤测定方法，观察选择表达EGFP标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫自交续代为F2代，F2代以后均采用蛾区育，成虫自交续代，再经2代选种，每代在小蚕期采用转基因昆虫荧光基因表达相对量无损伤测定方法，以表达EGFP标志基因为留种筛选标志，创制家蚕丝腺生物反应器，育成中部丝腺细胞、后部丝腺两部分细胞都能够特异性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因纯合的转基因家蚕新品种。

2.根据权利要求1所述的一种家蚕丝腺细胞合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的方法，其特征在于：所述的pBSer1RVGP-A3EGFP质粒是以piggyBac转座质粒为基础，质粒带有Amp抗性基因以用于质粒的扩增和筛选，包含 piggyBac转座子的2个转座臂PBL和PBR，包含 2个功能表达框，一个是A3启动子启动的绿色荧光蛋白基因表达框A3 Promoter+EGFP+SV40，以用作转基因阳性家蚕的筛选标志，另一个是家蚕丝胶蛋白1启动子、带有便于提纯外源蛋白的His接头以及狂犬病病毒糖蛋白基因的表达框Ser1 Promoter +His+ RVGP +SV40，依靠家蚕丝胶蛋白1启动子Ser1 Promoter具有中部丝腺细胞组织特异性启动基因表达的功能，创制家蚕中部丝腺细胞生物反应器，实现在中部丝腺细胞表达狂犬病病毒糖蛋白。

3.根据权利要求1所述的一种家蚕丝腺细胞合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的方法，其特征在于：所述的pBFibLRVGP-A3EGFP质粒是以pBSer1RVGP-A3EGFP质粒为基础，用家蚕丝素蛋白轻链启动子Fib-L Promoter替换家蚕丝胶蛋白1启动子Ser1 Promoter构建而成，依靠家蚕丝素蛋白轻链启动子Fib-L Promoter具有后部丝腺细胞组织特异性启动基因表达的功能，创制家蚕后部丝腺细胞生物反应器，实现在后部丝腺细胞表达狂犬病病毒糖蛋白。

4.根据权利要求1所述的一种家蚕丝腺细胞合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的方法，其特征在于：所述的辅助质粒包含Amp抗性基因、piggyBac转座子的1个转座臂PBR、A3启动子启动的转座酶trans基因表达框A3 Promoter+ trans，以提供转座酶。