[发明专利]猪纤维蛋白原冻干加热病毒灭活的方法

说明书

技术领域

本发明属于动物血液制品分离纯化技术领域，特别涉及一种医用生物制品生产过程中的病毒灭活控制工艺。

背景技术

传统血液制品的病毒灭活或去除技术主要有：

巴斯德加热处理法：此法的理论依据是通过对温度及作用时间的选择，使病毒结构的破坏速率远远大于蛋白质结构的破坏速率。液态加热60℃，处理20h，并在有保护凝血因子稳定剂存在的情况下，可有效地灭活血液制品中的各种病毒。

S/D处理法：其原理是有机溶剂可使类脂从病毒表面脱落，使病毒结构被破坏从而失去感染活性。灭活病毒后的血液制品成品，并通过亲和层析法、两次离子交换吸附法、乙醇沉淀法、凝胶过滤法、超滤法、萃取法等方法去除所添加的S/D试剂。

流动蒸汽加热处理法：此法是加热处理法中较为有效的一种方法，此方法是将湿润的冻干凝血因子浓缩物置于一定温度的热空气中加热一定时间进行处理，如在60℃的热蒸汽中加热10h。

悬浮加热处理法：其是将凝血因子浓缩物悬浮于氯仿和庚烷中，经60℃加热处理20h。但此法对肝炎病毒灭活不彻底。

照射法：通过阿尔法射线和紫外线照射处理。这种物理方法处理血液制品不会残留有现在危害的物质于制品中。

发明内容

本发明公开了一种猪纤维蛋白原冻干加热病毒灭活的方法，其解决了医用猪血制品生产上病毒灭活的问题，降低了动物源性病毒感染的风险，并保证了病毒灭活的效果。

本发明采取以下技术方案：猪纤维蛋白原冻干加热病毒灭活的方法，其按以下步骤：

a.对猪血浆进行预处理，获得猪纤维蛋白原浓缩液；

b.在浓缩液中加入基团保护剂；(添加基团保护剂，使得猪纤维蛋白原制品经热处理后蛋白活性保持)

c.将浓缩液的pH调节至7.5-8.5；

d.浓缩液通过孔径0.2μm滤器；

e.将浓缩液采用2.5mL管制瓶无菌灌装冷冻干燥后轧盖密封，获得猪纤维蛋白原冻干品；

f.将猪纤维蛋白原冻干品在65±2℃条件下保温140±1小时(保证病毒灭活的效果)，对其进行干热病毒灭活。

所述猪纤维蛋白原冻干加热病毒灭活的方法，步骤a，预处理包括盐析、多步过滤、S/D病毒灭活和超滤等操作。

所述猪纤维蛋白原冻干加热病毒灭活的方法，步骤b，基团保护剂为甘露醇、蔗糖及甘氨酸。

所述猪纤维蛋白原冻干加热病毒灭活的方法，步骤d，滤器过滤滤芯的材料采用20英寸聚偏氟二乙烯，规格为孔径0.2μm。

所述猪纤维蛋白原冻干加热病毒灭活的方法，步骤f，将猪纤维蛋白原冻干品放置入隔水式恒温箱，使其在65±2℃条件下保温140±1小时进行干热病毒灭活。优选的，恒温箱装载量不超过5000瓶。

本发明经中国药品生物制品检定所(中检函[2008]624号)检定，添加Sindbis病毒、PPV病毒进行验证，灭活效果显著。

本发明通过冻干品杀灭病毒方法简便可行，杀灭病毒效果良好，降低对干热灭毒无菌环境的要求，减小了猪纤维制品中动物源性病毒感染的风险，避免了传统病毒灭活对产品蛋白等生物活性的影响。

具体实施方式

下面对本发明实施例作详细说明。

实施例1

a.首先向猪血浆中添加硫酸铵至浓度20％饱和度进行盐析，搅拌至粗纤维蛋白原析出，静置后收集纤维蛋白原；稀释纤维蛋白原，添加适量抗凝剂；将纤维蛋白原溶解液分别通过孔径为5μm、0.45μm、0.22μm的滤器进行过滤，并进行截留相对分子量为8-10万的聚砜超滤膜超滤；添加磷酸三丁酯及聚山梨醇适量，进行S/D病毒灭活并经过0.45μm滤器过滤；乙醇沉淀后获得纤维蛋白原浓缩液；

b.加入质量百分比1％的基团保护剂为甘露醇、蔗糖及甘氨酸；

c.pH调节至7.8；

d.除菌过滤，通过孔径0.2μm(20英寸聚偏氟二乙烯)滤器；

e.采用2.5mL无菌灌装，冻干轧盖操作，获得猪纤维蛋白原冻干品；

f.将猪纤维蛋白原冻干品在隔水式恒温箱内，控制温度63℃条件下，保温139小时，进行干热病毒灭活。

g.采用6孔盘蚀斑法检出Sindbis病毒滴度＜1.0LgPFU/mL，PPV病毒滴度＜0.50LgTCID₅₀/0.1ml。

实施例2