[发明专利]一种结合SOLID测序和单细胞RT-PCR的人抗体可变区获取方法

说明书

技术领域

本发明涉及人类特异性抗体可变区序列获取技术领域，特别涉及一种结合SOLID测序和单细胞RT-PCR的人抗体可变区获取方法。

背景技术

从2002年的SARS大规模爆发，到2008年EV71病毒引发的手足口病，再到2009年墨西哥甲型H1N1流感病毒引发的全球流感大流行，一旦爆发它们就很快在大范围内或全球蔓延。常规的抗病毒药物开发是一个漫长的过程，无法在短时间内满足需要。而且，这些感染病菌的变异之快，使得我们在短时间内找到行之有效的防控办法变得越来越困难。对于这类病原体引发的爆发性、流行性疾病，非常迫切需要在很短时间内找到有效的预防和治疗方法。抗体治疗已成为多种疾病特异性治疗的新型手段和发展方向。尤其是全人源化单克隆抗体与人体结合性最好，也是最安全和有效的单克隆抗体，必将代表未来抗体治疗的发展方向。

目前获得全人源化抗体方法有抗体库筛选技术、基因工程小鼠制备全人抗体、转染色体牛。

抗体库筛选技术主要包括噬菌体抗体库和核糖体展示技术。

噬菌体抗体库技术：从免疫或未被免疫的B细胞中分离抗体可变区基因；PCR扩增抗体全套基因片段(如VH、VL)，将体外扩增的VH、VL基因片段随机克隆入相应载体，形成组合文库；将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因III(g3)或基因VIII(g8)的先导系列下游，使外源基因表达的多肽以融合蛋白的形式展示在外壳蛋白gp III或gp VIII的N端。用固相化抗原经“亲和结合-洗脱-扩增”数个循环筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。

核糖体展示技术：将基因型和表型联系在一起，编码蛋白的DNA在体外进行转录与翻译，由于对DNA进行了特殊的加工与修饰，如：去掉3′末端终止密码子，核糖体翻译到mRNA末端时，由于缺乏终止密码子，停留在mRNA的3′末端不脱离，从而形成蛋白质-核糖-2mRNA三聚体，将目标蛋白特异性的配基固相化，如：固定在ELISA微孔或磁珠表面，含有目标蛋白的核糖体三聚体就可在ELISA板孔中或磁珠上被筛选出，对筛选分离得到的复合物进行分解，释放出的mRNA进行逆转录酶链聚合反应(RT-PCR)，PCR产物进入下一轮循环，经过多次循环，使目标蛋白和其编码的基因序列得到富集和分离。

上述全人源化抗体技术中，制备和生产流程复杂，需要时间和周期漫长，无法适用于某些突发、流行性疾病的抗体药物的研发和生产，且对某些病原体或抗原快速变异方面显得无能为力。人源化抗体最关键的技术在于特异抗体可变区基因序列的扩增。由于每个抗原有很多抗原决定簇，机体免疫系统会针对不同的抗原决定簇产生不同的抗体，而且根据抗原决定簇的不同，所产生抗体与抗原的结合能力和抗体的效价也不相同。因此，要从成千上万的抗体中将效价高，结合能力强的特异抗体的可变区基因挑选出来，传统方法的工作量可想而知。

发明内容

为了克服现有技术存在的不足，本发明提供一种结合SOLID测序和单细胞RT-PCR的人抗体可变区获取方法，旨在结合传统的RT-PCR技术和高效的SOLID测序技术快速获得人类抗体可变区序列。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种结合SOLID测序和单细胞RT-PCR的人抗体可变区获取方法，其具体步骤如下：

(1)从特异免疫力供体获取抗凝外周血；

(2)分离外周血单核细胞(PBMCs)；

(3)以CD3^-和CD19⁺为gate对PBMCs进行初次分选；

(4)以CD27^high和CD38^high为gate对初次分选的细胞再次分选；

(5)获取具有抗体分泌功能的浆细胞，并稀释成单细胞；

(6)裂解单细胞并进行反转录获得单细胞cDNA序列；

(7)IgG/M特异引物PCR扩增；

(8)Barcoded Primers测序引物PCR扩增；

(9)SOLID芯片测序，生物信息学分析，获得抗体可变区基因序列。

本发明带来的有益效果是：提供了一个良好的技术平台，可广泛用于获取多种传染性/感染性、肿瘤性疾病、自身免疫性疾病中特异性抗体的重链和轻链可变区序列。特别是针对某些突发、重大流行性疾病，如SARS、禽流感等疾病时，该技术更能体现出其快速，高效的优势。此外，本发明也为全人源化抗体药物的生产提供了一个有效手段。

附图说明

图1为人类抗体可变区扩增图