[发明专利]一种高效结合IgG的重组蛋白A及其工程菌的构建方法

权利要求书

1.一种高效结合IgG的重组蛋白A及其工程菌的方法，其特征是根据NCBI公布的基因序列利用DNAMAN对蛋白A的五个IgG抗体结合区E、D、A、B、C区域设计引物，并在蛋白A的C端引物上添加了一个半胱氨酸，做为亲和层析的配基使用时利用半胱氨酸的巯基结合活化介质，增加蛋白A对IgG的吸附容量。

2.构建克隆重组质粒pMD18-T-spa其目的在于保存目的基因，减少每次连接都需PCR的工作量；其特征是以金黄色葡萄球菌染色体为模板，克隆得到大量编码蛋白A的基因，然后与克隆载体pMD18-T连接，得到重组质粒pMD18-T-spa，将重组质粒转化到感受态E.coil JM109进行复制和保存；

(1)克隆蛋白A抗体结合区基因

根据权利要求1所设计的引物对金黄色葡萄球菌基因组进行PCR得873bp的特异性条带；

(2)构建重组质粒pMD18-T-spa

利用凝胶回收试剂盒对目的基因进行回收，将回收到的目的基因与pMD18-T质粒16℃过夜连接，转化感受态E.coli JM109，利用氨苄青霉素平板挑取阳性菌落，转接到LB培养基37℃振荡培养12h，提取质粒，酶切验证正确后用甘油于-20℃保藏菌种。

3.构建重组质粒pET-28a-spa，其特征是提取权利要求2所构建菌的质粒，用BamH I和Noc I对所提取质粒和质粒pET-28a双酶切，利用T4DNA连接酶于16℃过夜连接，转化感受态E.coli BL21，利用卡那霉素平板挑取阳性菌落，转接到LB培养基中，37℃振荡培养12h，提取质粒，酶切验证正确后加入甘油，于-20℃保藏菌种。

4.重组蛋白A的诱导表达及其SDS-PAGE验证，其特征在于活化权利要求3构建的表达菌株，转接到LB培养基中，当菌液OD₆₀₀约0.6～0.8时添加终浓度1mmol/L的IPTG，于30℃诱导表达，振荡培养过夜，次日将菌液离心，弃上清，用pH7.6的Tris-HCl充分悬浮细胞，加入25％(v/v)的上样缓冲液，沸水浴30min，离心后取上清液进行SDS-PAGE验证，SDS-PAGE采用5％的浓缩胶和15％的分离胶。