[发明专利]单管多引物小型集合HIV核酸检测试剂盒

说明书

  

技术领域

本发明涉及一种检测试剂盒，具体地说是一种单管多引物小型集合HIV核酸检测试剂盒。

背景技术

HIV感染后抗体出现之前的急性感染者，血液中病毒载量很高，且未意识到其感染状态，传播HIV的危险性远远高于慢性感染者，因此早期发现这些感染者具有非常重要的公共卫生意义。目前我国艾滋病疫情正在从高危人群向一般人群扩散，性传播成为艾滋病传播主要途径。男男同性恋（MSM）是HIV感染的高危人群，及早发现其中的感染者进行干预可以达到事半功倍的效果。对于这些人群的早期发现主要依靠检测病毒抗原和核酸检测。近年开发出了针对献血人群HIV感染筛查的核酸检测技术（nucleic acid amplification technology，NAT），采用小型集合（mini-pool，MP）样本检测和核酸定量检测技术相结合的方法，将数量不等的待检样本混合成一份样品进行检测，如阴性就放行，如阳性就将混合样本逐一进行单份检测，以确定是哪一份标本阳性，采用这种方法可以显著降低大样本量HIV感染筛查的成本。目前该方法已在欧美一些发达国家应用于血浆样本的筛查，但是相对于发展中国家，成本依然较高，需要特殊仪器，使其推广应用受到限制。因此，需要开发价廉、易于操作、敏感和特异的检测方法。本文报告了一种根据我国主要流行的HIV病毒株设计多套引物，结合小型集合和RT-PCR、巢式PCR等技术方法建立的用于HIV感染筛查的NAT，以及该方法在MSM中的检测结果。

HIV早期诊断主要依靠抗原检测和核酸检测。已经上市并广泛应用的HIV核酸定量检测方法主要有3种，分别是西门子公司的分支DNA杂交（bDNA）、罗氏公司（Roche）的RT-PCR和生物梅里埃公司的NucliSens EasyQ HIV-1检测技术。近几年定量检测技术逐渐开始用于HIV感染的诊断。但是，对每一份标本分别检测费用昂贵，病毒载量检测一般只作为判断患者病情和HAART疗效的指标。一些研究者采用多个样本集合结合定量核酸检测方法的NAT用于HIV感染急性期诊断。潘品良等建立了基于COBAS Amplicor的RT-PCR检测“窗口期”HIV感染者的方法，可达到50人份作为一个检测集合，但是该方法与普通PCR相比成本较高，且需要特定的仪器设备，不宜普及推广。且过多的标本混合，也增加漏检的可能，美国FDA批准的Gen-Probe公司使用每个集合16或8人份筛查方法，Roche 公司采用每个集合6人份的筛查技术。小样本集合可能更加灵敏、也符合成本效益原则。

发明内容

本发明的目的在于提出一种多引物小型集合HIV核酸检测试剂盒。

本发明的再一目的在于提出用于检测小型集合HIV核酸的引物组。

为了实现上述目的，本发明的发明思路为：建立单管多引物小型集合（mini-pool，MP）艾滋病病毒（HIV）RNA反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和巢式PCR结合的HIV核酸检测技术（NAT），并将其应用于男男同性恋（MSM）及其他高危人群窗口期的检测。方法  将10份待测标本混合组成一个集合，高速离心富集病毒，提取病毒RNA；设计覆盖我国主要HIV流行株的4对特异性引物，采用单管多引物一步法RT-PCR、巢式PCR扩增，用梯度稀释的方法确定该方法的灵敏度，盲法验证该方法的特异性。

本发明的具体技术方案为：

一种单管多引物小型集合HIV核酸检测试剂盒，所述试剂盒组成如下：

试剂盒组成 成分      包装量（50人份）

一管式病毒RNA提取试剂  病毒RNA裂解液    50mL

一步法RNA PCR Kit (AMV)

AMVReverse Transcriptase XL  (5 U/μl)      50 μl

RNase Free ddH2O       1 ml × 2 支

RNase Inhibitor (40 U/μl)     50 μl

AMV-Optimized Ta q (5 U/μl)     50 μl

10 × One Step RNA PCR Buffer      250 μl

dNTP Mixture(各10 mM)     250 μl

MgCl 2 (25 mM)       500 μl

引物组合     SEQ ID No.1至8（各20μM）   50μl。