[发明专利]来自放射形土壤杆菌P230的磷酸三酯酶

说明书

本申请是申请号为02810046.8，申请日为2002年5月15日，发明名称为“来自放射形土壤杆菌P230的磷酸三酯酶”的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及能够水解有机磷酸酯(organophosphate，OP)分子的酶。具体而言，本发明涉及水解OP杀虫剂的磷酸三酯酶(phosphotriesterase enzyme)及其编码基因，该磷酸三酯酶鉴定自由土壤中分离得到的放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)菌株。本发明还涉及该鉴定的磷酸三酯酶的突变体，所述的突变体具有改变了的底物特异性。

背景技术

有机磷酸酯杀虫剂是环境以及一系列日用品中的不良污染物。最具敏感性的领域包括土壤的污染、再循环的灌溉废水的污染(污染的废水被下游的灌溉者使用或直接让其流出农场)、以及在农业和园艺出口商品中存在超标的残余物。有机磷酸酯类中毒是接触此类化学品的农业工人面临的一个问题，对于在化学战中接触有机磷酸酯类的军事人员来说也是如此。此外，战略储备的有机磷神经毒剂也需要进行解毒处理。因此，急需一些生物补救策略来清除或减少此类有机磷酸酯的残余物和/或储备。

提出的方案之一涉及使用能够使有机磷酸酯残基固定或发生降解的酶。这些酶例如可被用于生物反应装置通过其能够使被污染的水达到合格，或是用于洗涤溶液中以便在对水果、蔬菜或动物产品进行收获后杀虫能够降低残余物的水平和存留时间。适合用于对有机磷酸酯残余物进行降解的酶包括来自细菌的OP水解酶(Mulbry，1992；Mulbry和Kearney，1991；Cheng等，1999；US 5,484,728；US5,589,386)、来自脊椎动物的OP水解酶(Wang等，1993；1998；Gan等，1991；Broomfield等，1999)、以及来自OP抗性昆虫的OP水解酶(WO 95/19440和WO97/19176)。符合要求的OP水解酶应该能够快速降解有机磷酸酯残余物。

研究得最为深入的OP降解酶是细菌的有机磷酸酯二水解酶(organophosphate dihydrolase，OPD)，其由保藏号为ATCC 27551的黄杆菌菌种(Flavobacterium sp.)和缺陷短波单胞菌MG(Brevundimonas diminuta MG)(Harper等，1988；Mulbry和Karns，1989)中的不同的质粒上的相同的基因编码。OPD是一种同二聚体蛋白，能够水解很多种磷酸三酯(氧OP和硫OP均可)(Dumas等，1989a，b)。其反应机制直接或间接地涉及金属离子，优选为Zn⁺⁺。OPD对于磷酸单酯或二酯不具有可检测到的活性(Dumas等，1989a，b；1990)。

已经在大肠杆菌(Escherichia coli)(ePHP)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(mtPHP)和肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)(mpPHP)的基因组中鉴定出了OPD同源物(磷酸三酯酶同源蛋白(磷酸三酯酶homology proteins，PHP))，不过，仅对ePHP的磷酸三酯酶活性进行了测试(Scanlan和Reid，1995；Buchbinder等，1998)。在ePHP的组裂解物中未检测到其对任何一种测试的底物具有活性，例如p-硝基苯乙酸酯、双(p-硝基苯)磷酸酯、对氧磷(paraoxon)和p-硝基苯磷酸酯。

在脊椎动物中也鉴定出了OPD同源物(Davies等，1997)，尽管其在这些有机体中的功能仍是未知的。OPD、ePHP、mtPHP和哺乳动物的PHP在氨基酸水平具有27-30％的相同性，不过mpPHP的相同性稍低。涉及与Zn⁺⁺结合的氨基酸残基在迄今为止所鉴定到的磷酸三酯酶家族的六种成员中是保守的(Buchbinder等，1998)。