[发明专利]凡纳滨对虾精荚低温保存方法

权利要求书

1.一种凡纳滨对虾精荚低温保存的方法，包括精荚采集、精荚固定、精荚保存和精子染色过程，其特征在于：在常温条件下将精荚分装于EP管，采用配制的培养层包裹精荚，将包裹精荚EP管置于冰箱中，在4℃的低温下保存，具体操作过程为：

(1)精荚采集：在无菌细胞间内的超净工作台上左手握住对虾尾部，右手握住头部，然后用右手食指隔开最后一对步足，左手拇指挤压精荚，将采集的精荚先放入EP管中。

(2)精荚固定：常温条件下在无菌细胞间内的超净工作台上将每个精荚分装于EP管中，快速加入配制培养层包裹精荚，然后用封口膜封口。

(3)精荚保存：将(2)步包裹精荚的EP管放置于细胞培养室内的4℃保鲜箱中。

(4)精子染色：轻轻挤出精液并按1∶10稀释，取0.9mL的精子悬浊液移入试管中，加入0.1mL的0.4％的台盼蓝溶液，混匀，3分钟后将其滴入血细胞计数板中，在显微镜下观察着色的精子个数和精子总数，计算精子存活率。

2.根据权利要求1所述的保存方法，其特征在于：所述的精荚保存，每1周取出1个精荚用台盼蓝染色观察其成活率，放入培养层的体积数随着精荚的大小进行调节，确保3个月以上所保存的精子成活。

3.根据权利要求1所述的保存方法，其特征在于：所述的培养层具有固定和提供精荚所需的营养物质，其配方成分、体积份数及配制方法为：0.3～0.4份浓度为1.8～3.0％的自制I型液态鼠尾胶原与0.3～0.4份2×1640培养液，0.1～0.2份美国GIBCO公司的胎牛血清，0.1份美国Sigma公司的Matrigel装于放在冰盒的EP管中，充分混匀，加入0.1％的NaOH溶液，调节pH值7.2～7.4，备用。

4.根据权利要求3所述的保存方法，其特征在于：所述的培养液：采用美国GIBCO公司的1640培养基1袋，充分溶解于500ml过滤除菌的盐度为30％的海水中，配制成浓度为20.8g/L的2×1640培养液，并加入2.38g HEPES缓冲剂于溶液中至其终浓度为10mmol/L，加入用无菌的1mol/L NaOH调节pH至6.8～7.4之间，加入青霉素和链霉素调节其终浓度为100万单位，再经过0.22μm的滤器过滤分装成50mL/瓶，备用。

5.根据权利要求3所述的保存方法，其特征在于：所述的自制I型液态鼠尾胶原是将大鼠鼠尾，置于75％的酒精中浸泡30min，于无菌条件下撕下大鼠尾皮，将尾巴切成几段，抽出白色尾腱，浸入150ml的0.1％的醋酸中，置于4℃冰箱，并用磁力搅拌器进行搅拌，48h后以3000r/min的速度离心收集上清既得胶原溶液，计算所制备的胶原溶液的浓度。