[发明专利]用于检测NDM-1基因的LAMP试剂盒及其专用引物

权利要求书

1.用于对NDM-1基因进行LAMP检测的引物，是根据NDM-1基因特异性的保守靶序列设计的，用以定性检测纯菌、痰液、尿液、粪便样品中的NDM-1基因；所述NDM-1基因特异性的保守靶序列具有序列表中SEQ ID NO：7所示序列。

2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于：所述用于对NDM-1基因进行LAMP检测的六条引物的核苷酸序列具有序列表中SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示序列。

3.一种NDM-1基因的LAMP检测方法，包括以下步骤：

1)以待测物的基因组DNA为模板，在权利要求1或2所述引物的引导下进行LAMP扩增；

2)反应结束后进行结果判定：在反应液中添加羟基萘酚兰(HNB)，根据反应液的颜色变化判断结果，天蓝色表示待测样品中存在NDM-1基因，紫色表示待测样品中不存在NDM-1基因；或者不添加HNB直接用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化来判断结果，浊度上升表示待测样品中存在NDM-1基因，浊度无变化表示待测样品中不存在NDM-1基因。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述步骤1)中的25ul LAMP反应体系包括：待测物的基因组DNA 2μl，20mM Tris·HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱(betaine)，8mM MgSO₄，1.4mM dNTPeach，8U Bst DNA polymerase，引物加入量为：40pmol SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示引物，20pmol SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示引物，5pmol SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示引物。

5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述步骤1)中的LAMP扩增条件为：置60-65℃恒温45-55min，优选50min。

6.根据权利要求3或4或5所述的检测方法，其特征在于：所述步骤2)中羟基萘酚兰的添加量为1.25μl(终反应体系为26.25μl)，浓度为2.4mmol/L。

7.一种用于对NDM-1基因进行LAMP检测的试剂盒，包括权利要求1或2所述用于对NDM-1基因进行LAMP检测的引物。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含NDM-1基因的NDM-1细菌的DNA，所述阴性对照为不含DNA的LAMP扩增体系。

9.权利要求1或2所述的引物在NDM-1基因的LAMP检测中的应用。

10.权利要求7或8所述的试剂盒在NDM-1基因的LAMP检测中的应用。