[发明专利]高效转化虎杖苷为白藜芦醇的虎杖根内生菌G3

说明书

技术领域：

本发明涉及一种虎杖内生菌，尤指一种与虎杖的共发酵条件下可将虎杖苷转化为白藜芦醇的虎杖根内生菌G3。

背景技术：

虎杖中白黎芦醇是一种天然活性多酚物质，具有抑制肿瘤、抗氧化、抗自由基等作用，它已被列为抗心血管、抗癌最有前途的药物之一，是继紫杉醇以后的又一绿色抗癌物质。虎杖中白黎芦醇往往以虎杖苷的形式存在，干燥虎杖根茎中白黎芦醇含量仅为0.1％-0.2％，而虎杖苷含量约2％，虎杖苷在肠道中糖苷酶作用下分解为白黎芦醇，发挥其药理作用。

国内关于通过对虎杖中虎杖苷进行转化以提高白黎芦醇含量的报道较多，如自然酶解法、复合酶酶解法、及用纤维素酶对粗提取虎杖苷进行酶解；国外有学者采用提纯的葡萄糖苷酶对虎杖苷进行转化；还有用酸碱水解法分别对虎杖苷进行分解。以上方法专一性低、操作较繁琐，成本高、转化率低(1.23％-1.68％)，并对环境造成污染。而，从天然资源中采取化学等方法提取有效成分费时、费力、浪费资源，因此，微生物转化法逐渐应用于天然产物的研究中。但至今未见有关利用植物内生菌或人肠道内细菌对虎杖进行转化的报道。因此从筛选虎杖内生菌或人肠道内细菌对虎杖进行转化具有非常重要的意义。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种虎杖根内生菌G3，该菌与虎杖的共发酵下，可将虎杖苷转化为白藜芦醇。

本发明所述的虎杖根内生菌G3，其分类命名为草酸青霉(Penicillium oxalicum)G3，已于2011年1月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.4558。

本发明菌株G3的菌落形态：

在肉眼下观察到：

本发明菌株G3在CYA培养基上28℃培养7d后，菌落直径45mm左右；菌落外围白色；形成大量的孢子，产孢区颜色为青绿色；菌落边缘不整齐，无渗出液，无特殊气味，菌落背面黄色，见图1。

本发明菌株G3在MEA培养基上28℃培养7d后，直径达10mm-15mm，菌落菌落边缘不整齐，无渗出液，无特殊气味，菌落背面黄色，见图2。

本发明菌株G3在G25N培养基上生长局限，28℃培养7d后，直径7mm-10mm。菌落外围白色，中间有少量的青灰色孢子，菌落背面浅黄色，见图3。

本发明菌株G3在CA培养基上28℃培养7d，直径45mm，菌落边缘不整齐；菌丝白色，中央到边缘浅绿变深绿，菌落背面黄色，见图4。

用SDS法提取本发明菌株的DNA，采用通用引物ITS1/ITS4进行PCR扩增，获得扩增片段，扩增片段测序。序列经GenBank中BLAST同源性比对，结果表明本发明菌株与登陆号为FJ977097.1的草酸青霉(Penicillium oxalicum)同源性最高，相似性为100％，结合菌落形态和显微特征结果，可以判定本发明菌株为草酸青霉(Penicillium oxalicum)的一个新种，命名为草酸青霉(Penicillium oxalicum)G3。

将本发明菌株G3接入10％虎杖煮提液(pH自然)中，经本发明菌株与虎杖的共发酵可转化虎杖中的虎杖苷为白藜芦醇，发酵条件为：菌株孢子悬浮液浓度1×10⁶CFU/mL，接种量为10％，温度为27-29℃，160-200rpm摇床发酵培养84-96h。较佳的发酵条件为：菌株孢子悬浮液浓度1×10⁶CFU/mL，接种量为10％，温度为28℃，转速为180rpm，发酵时间为96h。

如此，通过微生物发酵可直接将虎杖中的虎杖苷转化为白藜芦醇，不需要进行虎杖苷的提取，可节约成本，减少对环境的污染。

附图说明：

图1是本发明菌株在CYA上培养7d后的菌落图。

图2是本发明菌株在MEA上培养7d后的菌落图。

图3是本发明菌株在G25N上培养7d后的菌落图。

图4是本发明菌株在CA上培养7d后的菌落图。

图5是虎杖苷标样(40μg/ml)HPLC图(图中1指虎杖苷标准曲线)。

图6是白藜芦醇标样(40μg/ml)HPLC图(图中2指白藜芦醇标准曲线)。

图7是发酵前培养液中虎杖苷、白藜芦醇含量HPLC检测图谱。

其中：曲线1指虎杖苷，曲线2指白藜芦醇。

图8是发酵96h后的发酵液中虎杖苷、白藜芦醇含量HPLC检测图谱。

其中：曲线1指虎杖苷，曲线2指白藜芦醇。

具体实施方式：