[发明专利]奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌-大肠埃希氏菌二联多价疫苗及其制备方法

权利要求书

1.奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌-大肠埃希氏菌二联多价疫苗，其特征在于：所述疫苗按体积份数比包括4份抗原，所述抗原包括a，金黄色葡萄球菌金黄色亚种Staphylococcus aureus subsp.aureusCGMCC NO.4595、 4596、4597、4598的菌体多糖、蛋白抗原中任意2种或2种以上的组合；b，CGMCC NO.4595、4596、4597、4598毒素抗原中任意2种或2种以上的组合；c，大肠埃希氏菌Escherichia coliCGMCC NO.4594的菌体蛋白抗原；d，CGMCC NO.4594的毒素抗原；和6份的e，Montanide ISA70M VG免疫油佐剂组成。

2.根据权利要求1所述的奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌-大肠埃希氏菌二联多价疫苗，其特征在于所述4份抗原中，CGMCC NO.4595、4596、4597、4598菌体多糖、蛋白抗原中任意2种或2种以上的组合含50%； CGMCC NO.4594菌体蛋白抗原含12.5%；CGMCC NO.4595、4596、4597、4598毒素抗原中任意2种或2种以上的组合含12.5%；CGMCC NO.4594毒素抗原含25%。

3.一种根据权利要求1所述的奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌-大肠埃希氏菌二联多价疫苗的制备方法，其特征在于该方法具有以下步骤：

（1）CGMCC NO.4595、4596、4597、4598菌种和CGMCC NO.4594菌种的制备；

（2）CGMCC NO.4595、4596、4597、4598的菌体多糖、蛋白抗原和CGMCC NO.4594的菌体蛋白抗原的制备；

（3）CGMCC NO.4595、4596、4597、4598的毒素抗原和CGMCC NO.4594的毒素抗原的制备；

（4）将上述获得的CGMCC NO.4595、4596、4597、4598的菌体多糖、蛋白抗原中的任意2种或2种以上的组合与获得的CGMCC NO.4595、4596、4597、4598的毒素抗原中的任意2种或2种以上的组合与CGMCC NO.4594的菌体蛋白抗原与CGMCC NO.4594的毒素抗原与Montanide ISA70M VG免疫油佐剂按上述体积份数比混合，制成疫苗。

4.根据权利要求3所述的奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌-大肠埃希氏菌二联多价疫苗的制备方法，其特征在于所述CGMCC NO.4595、4596、4597、4598菌种中的任意一种都可以按照以下步骤制备：

（1）无菌条件下挑取少量菌种，在含有7%绵羊血平板上划线，将其放置在温箱内培养，温度控制在37℃下培养24-28h；

（2）从培养的菌种中挑取单个菌落，接种到改良的哥伦比亚培养基试管中，放置在振摇培养箱中培养20h，振摇培养箱温度保持在37℃,振摇速度保持170rpm；

（3）从试管中取培养物接种到改良的哥伦比亚液体培养基三角瓶中，接种量为培养剂量的1%，将其放置在振摇培养箱中培养20h，振摇培养箱保持37℃，振摇转数保持170rpm；

（4）培养物镜检无杂菌后，放置在4℃冰箱中备用。

5.根据权利要求3所述的奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌-大肠埃希氏菌二联多价疫苗的制备方法，其特征在于所述CGMCC NO.4594菌种按照以下步骤制备：

（1）无菌条件下挑取少量菌种，在LB固体培养平板上划线，将其放置在温箱内培养，温度控制在37℃下培养24h；

（2）无菌条件下，从培养的菌种中挑取单个菌落，接种到LB液体培养基试管中，放置在振摇培养箱中培养20h，振摇培养箱温度保持在37℃,振摇转数保持170rpm；

（3）从试管中取培养物接种到LB液体培养基三角瓶中，接种量为培养剂量的1%，将其放置在振摇培养箱中培养20h，振摇培养箱保持37℃，振摇培养速度保持170rpm；

（4）对培养物镜检无杂菌后，放置在4℃冰箱中备用。