[发明专利]西红花干品的DNA指纹图谱鉴定方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属生物医药领域，具体涉及西红花的DNA指纹图谱鉴定方法及其应用。

技术背景

近年来，DNA分子鉴定技术已经广泛的应用到中药材的品种鉴定等研究领域。DNA分子标记能反映生物个体或种群基因组中某种差异特征的DNA片段，能够直接反映基因组DNA间的差异。PCR（polymerase chain reaction，是特异DNA的体外酶促快速扩增反应）与分子生物学技术的广泛应用，也推进了ISSR、RAPD、SSR、RFPL、AFLP等技术在植物分类与中药材鉴别方面的应用，并且占据着十分重要的位置。

中国药典2010版一部收载，中药西红花是鸢尾科番红花属植物番红花Crocus sativus L.的干燥柱头，具有活血化瘀，散郁开结，凉血解毒等功效。西红花在临床上用于治疗忧思郁结，胸膈痞闷，吐血，伤寒发狂，惊怖恍惚，妇女经闭，血滞月经不调，产后瘀血作痛，跌打损伤等。西红花价格十分昂贵，被誉为“植物黄金”。市售假冒伪劣的藏红花产品层出不穷、屡见不鲜。

现有的藏红花鉴别技术仍然是以性状鉴别、理化鉴别和显微鉴别为主。这些方法虽然简单，但是专属性差，检测指标不能量化，同时受到实验操作者的主观因素影响大。中国药典2010版一部采用薄层色谱法和高效液相色谱法对西红花进行鉴别和含量测定的考察。但不同产地的藏红花、栽培藏红花与组培藏红花在主要成分有显著差异，同时在成分的种类和含量方面也有很大的差别，因此用薄层或高效液相色谱法从化学成分上鉴别西红花样品的真伪存在一定的局限性。特别是，对于西红花的鉴别，前人的研究几乎都是针对西红花鲜品，而西红花干品药材的DNA降解非常严重，西红花鲜品的鉴别方法不能完全适用于西红花干品。而目前还没有针对西红花干品药材DNA指纹图谱鉴定方面的文献报道。

发明内容

为克服以上技术问题，本发明提供了一种西红花干品的DNA指纹图谱鉴定方法及其应用。特别适用于西红花干品的鉴定，具有高专属性、准确性和重现性的优点。

该方法的总体构思是：从100个UBC系列引物中进行筛选，得到适用于ISSR（Inter-Simple Sequence Repeats）分析的三个特殊引物，所述的三个引物均可以用来准确鉴定西红花干品。

UBC系列的引物是指由加拿大不列颠哥伦比亚大学（University of British Columbia, 简称UBC）命名的系列简单重复序列的3'端或5'端加上2～4个随机核苷酸。现全球均采用这套命名规则。

本发明的技术方案为：

一种西红花干品的DNA指纹图谱鉴定方法，其特征在于，采用以下三个特异鉴别引物中的任一种进行对比鉴定。

1.UBC868: GAAGAAGAAGAAGAA(5'to3')(如SEQ ID NO:1)；

2.UBC859: TGTGTGTGTGTGTGTGAC (5'to3') (如SEQ ID NO:2)；

3.UBC818:CACACACACACACACAG (5'to3') (如SEQ ID NO:3)。

适用于西红花饮片鉴定、含西红花干品组分的中药制剂鉴定的应用。

鉴定的具体步骤为：

取西红花干品药材，提取DNA。建立PCR反应体系：在200μL PCR管中进行，反应总体积为25μL，反应体系包括10×PCR缓冲液2.5μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，引物10 μmol/L 2μL，高保真TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.125μL，模板DNA 2μL，无菌双蒸水16.375μL。其中，鉴别引物有：

1.UBC868: GAAGAAGAAGAAGAA(5'to3')；

2.UBC859: TGTGTGTGTGTGTGTGAC(5'to3')；

3.UBC818:CACACACACACACACAG (5'to3')。

按照琼脂糖凝胶电泳法（中国药典2010版三部附录Ⅵ B），胶浓度为1.2%，胶中加入核酸凝胶染色剂（终浓度为0.05%），供试品与对照药材PCR反应液的上样量均为5μL，DNA分子量标记上样量为3μL (100μg/μL)。电泳结束后，取凝胶片在凝胶成像仪上检视。供试品凝胶电泳图谱中，在与对照药材电泳图谱相应位置上应有相同DNA条带。

相对于现有技术，本发明具有如下的优点：

①   专属性、准确性、重现性好。结果真实、稳定、可靠。

②   不受样品形态限制，原药材、饮片、粉末乃至丸剂、散剂之类生药原型的中成药均可应用。