[发明专利]一种发酵法生产天然β-胡萝卜素的方法和应用

说明书

技术领域

本发明利用微生物发酵生产β-胡萝卜素，包括发酵方法的改进及β-胡萝卜素的提取纯化方法，属于生物化工领域。

发明背景

类胡萝卜素是自然界中发现最多且分布广泛的一类色素物质，类胡萝卜素化合物广泛应用于食品、化妆品、药品等的着色，近年来，研究发现类胡萝卜素对预防、延缓和治疗某些疾病，提高机体免疫力方面具有较好的疗效。

β-胡萝卜素是一种重要的类胡萝卜素，其化学式C₄₀H₅₆，分子量536.88，由四个异戊二烯双键首尾相连而成，主要由全反式、9-顺式。13-顺式及15顺式四种形式，分子结构式如下：

在其分子结构的两端各有一个β-紫萝酮环，此β-紫萝酮可能以异构性、取代型、开环型的形式存在。

β-胡萝卜素具有重要的生理功能，可以作为维生素A的前体，是联合国粮农组织和世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会认定的A类营养食品强化剂。有研究表明β-胡萝卜素作为维生素A的前体具有抗氧化、影响繁殖和甲状腺功能等作用。β-胡萝卜素分子中的多个双键，在光、热、氧气及活泼性较强的自由基离子存在下，易被氧化，从而起到抗氧化的作用，保护机体不被破坏。除此之外研究还表明β-胡萝卜素还具有增强免疫力，提高人体抗癌能力；促进细胞间的连接与交流；抗尼古丁作用等。

β-胡萝卜素具有全化学合成和天然来源。全化学合成法得到的β-胡萝卜素由于可能存在着一些化学中间体杂质，近来年，人们越来越偏向于天然来源的β-胡萝卜素，而天然来源的β-胡萝卜素往往又有三种生产方法，分别是从天然植物中提取，通过盐藻养殖得到以及通过微生物发酵法生产。通过从胡萝卜等含微量β-胡萝卜素蔬菜中提取、分离，可获得一定量的天然β-胡萝卜素，采用这种方法生产的不足很显然是耗费原料多、产量低。第二种方法是通过大面积养殖盐藻获得，如大面积养殖杜氏盐藻，通过溶剂萃取法获得，但是盐藻养殖受外界环境条件的严格限制，使其规模很难壮大，远远不能满足市场需求。第三种方法是通过微生物发酵法生产，采用这种方法生产天然β-胡萝卜素因不受环境条件限制、产量高、易于实现工业化生产而受到重视，有越来越多的研究机构和生产厂家投入到这方面的研究中去。国内外用于生产天然β-胡萝卜素的微生物菌种主要有分支杆菌、红酵母等，但应用最为广泛的还是丝状真菌，如三孢布拉霉、好食脉孢霉等，其中又以三孢布拉霉应用为多。

应用三孢布拉霉生产天然β-胡萝卜素一般是通过其两种菌株如(+)和(-)菌株进行混合发酵生产的，其具体的代谢途径在先前文献WO 00/77234，Caglioti L.et al.(1966)中有较为详尽的描述，在近阶段的研究中主要集中于如何改变发酵条件或添加前体物质以提高发酵单位，以及如何有效地从发酵菌丝体中分离得到高质量的β-胡萝卜素纯品。较多的专利文献中有这方面的报道，并提出了很多改进措施，但这些措施或者生产工艺中往往存在着这样或那样的技术缺陷，或者由于发酵单位低以至成本高，不利于工业化生产；或者没有采用合适的方法，不仅使提取纯化β-胡萝卜素的工艺复杂，而且使发酵得到的胞内产物不易被提取完全；或者在提取纯化过程中用到毒性较大的有机溶剂，存在食用安全风险；或者得到的β-胡萝卜素含量不高，存在较多的杂质。

U.S.Patent 3,752,740通过在培养基中添加7.5％的柠檬酸，应用三孢布拉霉发酵生产天然β-胡萝卜素，但最终发酵液中发酵单位很低，不适于工业化生产。

U.S.Patent 7,252,965中公开了对三孢布拉霉的筛选优化，并在发酵过程中通过添加前体物质β-紫罗兰酮和强制增大溶解氧等措施以增加发酵液中β-胡萝卜素的产量，最终发酵液中β-胡萝卜素单位可达9g/l，此工艺中并未涉及到任何从菌丝体中提取β-胡萝卜素的过程。

CN1,193,048 A中提供了一种在气升式发酵罐中培养丝状真菌发酵制备β-胡萝卜素的工艺。其过程包括一级种培养和二级种培养及发酵过程。其PDA培养基由葡萄糖、马铃薯和琼脂培养基组成，二级种培养和发酵培养时培养基组成为淀粉、葡萄糖、淀粉、玉米浆、磷酸氢二钾、硫酸镁、盐酸硫酸胺、植物油等。此工艺中只是通过设备方面的改进来改善溶氧，发酵液中单位低，而且浸提时用到大量如正己烷等毒性较大的有机溶剂。