[发明专利]一种提高工程大肠杆菌间苯三酚合成能力的方法

权利要求书

1.一种提高细胞合成间苯三酚的能力的方法，所述方法包括在所述细胞中表达多重抗性因子(MarA)(GenBank登录号：6060688)。

2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括在所述细胞中表达乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)(GenBank登录号：6062185、6058890、6058863或6059083)。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述细胞能够表达聚烯酮酐合成酶(PhlD)(GenBank登录号：EU554263)。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述细胞是荧光假单胞菌(Psendomonas fluorescens)或导入了能够表达聚烯酮酐合成酶(PhlD)的表达载体的重组大肠杆菌细胞(Escherichia coli)。

5.根据权利要求4所述的方法，其中在所述重组大肠杆菌细胞中共表达编码聚烯酮酐合成酶(PhlD)的基因phlD、编码多重抗性因子(MarA)的基因marA和编码乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)的ACCase基因，优选所述共表达是通过一个、两个或更多个用于共表达这些基因的表达质粒来实现的。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述phlD基因是来源于细菌，优选来源于荧光假单胞菌，或是和phlD基因同源性超过70％的核酸序列，或来源于其它生物体，和phlD基因没有明显的同源性，但和phlD具有相同或相似功能的核酸序列；

所述marA基因是来源于细菌，优选大肠杆菌，或是和marA同源性超过70％的核酸序列，或来源于其它生物体，和marA基因没有明显的同源性，但和marA具有相同或相似功能的核酸序列；和

所述ACCase基因是来源于细菌，优选大肠杆菌，或是和ACCase基因同源性超过70％的核酸序列，或来源于其它生物体，和ACCase基因没有明显的同源性，但和ACCase具有相同或相似功能的核酸序列。

7.一种用于合成间苯三酚的重组细胞，其中该细胞共表达：编码聚烯酮酐合成酶(PhlD)的基因phlD；以及编码多重抗性因子(MarA)的基因marA和编码乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)的ACCase基因中的至少一个、优选两个，更优选所述细胞是大肠杆菌细胞，还更优选所述共表达是通过一个、两个或更多个用于共表达这些基因的表达质粒来实现的。

8.一种利用权利要求7所述的重组细胞生产间苯三酚的方法，所述细胞是大肠杆菌细胞，其中所述方法包括：

(1)将权利要求7所述的大肠杆菌重组细胞按体积比1-5％的接种量接种到发酵培养基中进行发酵，在培养温度30-37℃、搅拌速度400-800rpm、pH 6.0-8.0和溶氧18％以上的条件下培养至OD₆₀₀约为8-12，加入诱导剂IPTG至终浓度0.1-1mmol·L^-1，继续补料发酵12-24小时；

(2)将培养液进行离心，分离大肠杆菌菌体和上清，上清采用等体积的萃取剂萃取1-3次；

(3)合并(2)中所述萃取产物，减压蒸馏浓缩，所得固体粉末即为间苯三酚。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述方法适用于摇瓶培养或发酵罐培养。

10.根据权利要求8所述的方法，其中：

1)所述培养基为M9发酵培养基，并向其中添加了50μg·mL^-1卡那霉素和30μg·mL^-1氯霉素；

2)所述方法采用分批补料发酵，补料底物为40-80重量％的葡萄糖；和/或

3)所述萃取剂为乙酸乙酯。