[发明专利]一种大黄鱼生长激素基因的优化序列及其应用

说明书

技术领域

  本发明属于生物技术领域，具体涉及一种合成大黄鱼生长激素基因及其应用。

背景技术

毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统作为一种真核表达系统，不仅具备可高效、严格地调控外源蛋白表达的乙醇氧化酶（AOX1）启动子，而且可以对外源蛋白进行翻译后的加工，有利于表达出高产量的活性蛋白，便于工业化生产。此外分泌型蛋白简化了纯化步骤且糖基化程度低，对人体无明显的抗原性，同时也适合于临床治疗的用途。

大黄鱼生长激素（Pseudoscraena crocea growth hormone，pcGH）具有增强食欲、提高饲料转化率和促进鱼体生长等作用,且不会对人体产生激素副作用，可望用于解决大黄鱼养殖中存在的生长周期长、饲料利用率低、养殖成本高等问题。因此在鱼类的水产养殖领域有重大的应用价值，日益引起人们的关注。目前已有多种鱼类的生长激素被分离、纯化和表达，且等同于天然GH的生物活性，通过投喂鱼类显示较强的促生长作用。较之天然的鱼类生长激素，基因工程制备的GH具有操作简单、成本低且产量高等优点，易于实现产业化，在水产养殖中具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能在毕赤酵母中高效表达的合成大黄鱼生长激素基因，该基因能在毕赤酵母中高效表达重组大黄鱼生长激素，为高效率的工业化生产重组大黄鱼生长激素提供了可行性，并有助于拓宽重组大黄鱼生长激素的应用范围。

由于制约外源蛋白表达的主要因素是密码子的使用频率和外源基因序列的A+T组成，因此本发明通过对全基因序列进行优化，使得pcGH序列中相对使用度(relative synonymous code usage，RSCU)大于1.0的密码子达到95 %以上，并将AT含量控制在30 %-55 %之间，使A+T的含量控制在酵母表达的最佳范围内。通过化学方法合成pcGH基因，构建毕赤酵母的表达载体，利用化学转化技术，将该基因整合到毕赤酵母X-33菌株的染色体上并得以成功表达，表达量达到340 mg/L。该表达量是目前pcGH表达的报道中表达水平最高的。

本发明的特点如下：

（1）毕赤酵母表达系统较之原核表达系统不仅具有易操作、繁殖快等生产特点，还具备基因表达调控和蛋白修饰功能，大大提高产物的活性。同时，其高效分泌表达质粒在表达外源蛋白过程中可将目的蛋白分泌到胞外，既保持目的蛋白的活性，又简化了基因工程下游繁琐而昂贵的分离纯化等步骤。

（2）利用毕赤酵母表达鱼类的生长激素具备应用上的优势，酵母本身营养价值高可作为优质的饲料营养源，有望大规模应用于水产养殖业。

（3）考虑到外源基因的密码子主要在翻译水平上影响表达，而毕赤酵母具有自身特殊的密码子偏好。pcGH的密码子不仅经过全面优化，而且控制A+T的含量在毕赤酵母表达的最佳范围内。保证更高的表达量满足生产需要。

本发明的显著特点是提供优化的pcGH序列及其在毕赤酵母中的高效表达重组大黄鱼生长激素，有利于大规模的推广应用，具有较好的经济效益。

附图说明

图1为质粒图谱；

图2为构建的质粒电泳图；

图3为优化的pcGH序列（a 考染结果）和未经优化的序列（b 银染结果）在酵母中的表达SDS电泳图；

图4为不同试验组大黄鱼体重（a）、体长（b）变化的比较。

具体实施方式

菌种、载体以及试剂为：

毕赤酵母菌株（p.pastoris x-33）、大肠杆菌（E.coli DH5a）和质粒pPICZaA由福州大学生物工程研究所保存；大黄鱼购自福州市水产技术推广站连江大官坂基地育苗车间；配合饲料为海马饲料公司生产的大黄鱼幼鱼粉状饲料；Taq DNA polymerase，Xba I，Xho I，Hind Ⅲ，Sac I, RNase，T4-DNA Ligase，lDNA，Plasmid DNA Extraction Kit等购自上海Sangon生物工程公司或宝生物工程公司；Tryptone，Yeast Extract等购自英国OXOID公司；Zeocin抗生素，购自美国Invitrogen公司；琼脂糖胶回收试剂盒：购于Qigen公司；其它均为国产分析纯试剂。

具体步骤为：